Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƢƠNG LY PHÂN LẬP ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ TỪ SMV (SOYBEAN MOSAIC VIRUS) GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôi nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu, các tài liệu trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Hƣơng Ly Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này. Tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Lò Thị Mai Thu, cảm ơn Thạc sĩ Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA và Ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí nghiệm trong luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh và các Thầy, Cô trong khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tác giả Nguyễn Thị Hương Ly v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT bp Cặp base cs Cộng sự đtg Đồng tác giả DNA Deoxiribonucleic acid RNA Ribonucleic Acid kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris acetat EDTA CP Coat Protein DEPC Diethyl pyrocarbonate RNAi RNA interference RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung) IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase SMV Soybean Mosaic Virus vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 8 Bảng 2.1 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR nhân gen CP 24 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CP 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen CP vào vector tách dòng pBT 27 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 29 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL1 và X63771 40 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid của CP ở SMV dòng SL1 và CAA45307 43 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV 17 Hình 1.2 Sơ đồ protein vỏ của SMV 18 Hình 1.3 Vùng Poty_coat 18 Hình 2.1 Cấu trúc vecto pBT 26 Hình 3.1 Các mẫu lá đậu tương nghi nhiễm bệnh thu thập ở các tỉnh Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Nội 31 Hình 3.2 Kết quả xác định đoạn tương đồng của 96 trình tự gen CP khi so sánh bằng BLAST trong NCBI 34 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CP từ cDNA của SMV 35 Hình 3.4. Kết quả biến nạp vecto tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 37 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc 38 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen CP 39 Hình 3.7. Trình tự đoạn gen CP của SMV phân lập tại tỉnh Sơn La và trình tự gen CP của dòng virus SMV được đăng ký GenBank có mã số X63771 41 Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ virus SMV dòng SL và trình tự amino acid của 42 viii vùng Poty-coat của protein có mã số CAA45307 trên GenBank Hình 3.9 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina 43 Hình 3.10 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina 44 Hình 3.11 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina 45 1 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Một đặc tính quan trọng của cây đậu tƣơng là có nốt sần ở rễ có khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất. Hiện nay, năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng ở mức thấp là do nhiều giống hiện trồng có tính ổn định chƣa cao, sức biến động khá lớn giữa các miền, các vùng. Khả năng kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tƣơng đang trồng là rất thấp và chƣa có những dự báo về thời vụ gieo trồng thích hợp cho từng vùng và chƣa xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất cho từng vùng sinh thái. Theo kết quả điều tra về bệnh của Cục Bảo vệ thực vật trên cây trồng, đã xác định 20 loài bệnh hại, trong đó có các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho năng suất đậu tƣơng và hiện nay vẫn chƣa có biện pháp hiệu quả để phòng trừ bệnh do virus. Đậu tƣơng là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, nhƣ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tƣơng (Bean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus trên lá khác. Vì vậy, nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tƣơng sạch bệnh là rất cần thiết. Bệnh khảm lá đậu tƣơng do virus SMV gây nên. Virus lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới. Sự lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt. Hiện nay các biện pháp phòng bệnh phổ biến là: Chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống; vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dƣ cây bệnh trên đồng ruộng; diệt trừ 2 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ côn trùng truyền bệnh. Các biện pháp truyền thống thƣờng phức tạp, tốn thời gian, hiệu quả không cao và kém bền vững. Biện pháp hiệu quả nhất để phòng virus là sử dụng giống kháng virus, tuy nhiên, các nguồn kháng bệnh tự nhiên đối với các loại virus này không nhiều. Do vậy, phƣơng pháp chuyển gen để tạo cây kháng virus đặc biệt tỏ ra hữu ích đối với các loài thực vật mà trong tự nhiên khan hiếm nguồn kháng bệnh. Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen mã hóa protein vỏ từ SMV (Soybean mosaic virus) gây bệnh khảm lá ở đậu tương”. 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập và xác định đƣợc trình tự đoạn gen CP của virus SMV nhằm tạo nguyên liệu và thu thập thông tin để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi phục vụ nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng chuyển gen kháng virus SMV gây bệnh khảm lá. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1. Thu mẫu lá nghi nhiễm virus SMV từ các vùng trồng đậu tƣơng ở một số địa phƣơng thuộc phía Bắc Việt Nam. Lƣu giữ và bảo quản mẫu theo quy phạm. 3.2.Tách chiết RNA của virus SMV và tạo cDNA bằng phản ứng phiên mã ngƣợc. Nhân bản đoạn gen CP của virus SMV. 3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP của virus SMV. Phân tích và so sánh với trình tự đã công bố trên GenBank. 3.4. Phân tích sự đa dạng của một số dòng virus SMV dựa trên trình tự đoạn gen CP và trình tự amino acid suy diễn. 3 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng Cây đậu tƣơng là một trong những loại cây trồng đƣợc biết đến từ rất sớm. Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tƣơng có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tƣơng đƣợc thuần hóa và trồng làm cây lƣơng thực ở Trung Quốc và thế kỉ XVII trƣớc công nguyên. Cây đậu tƣơng đƣợc truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỉ thứ XVIII, du nhập vào nhiều nƣớc châu Á khác nhƣ : Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ , Việt Nam… vài thế kỉ sau đó. Cây đậu tƣơng đƣợc trồng ở châu Âu vào thế kỉ XVII và ở Hoa Kì vào thế kỉ XVIII [1]. Về phân loại học, cây đậu tƣơng hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill (2n=40) thuộc họ đậu (Lengminoceae), họ phụ cánh bƣớm (Papilionoideae). Về nguồn gốc và phân loại của cây đậu tƣơng đã đƣợc công bố bởi công trình của Hymowitz và Newell (1981). Đối với cây đậu tƣơng trồng đƣợc phân biệt theo đặc điểm thực vật học, dựa theo thời gian sinh trƣởng, thời vụ. Hiện nay, đậu tƣơng đƣợc trồng ở Việt Nam có nguồn gốc là các giống địa phƣơng và các giống nhập nội. Đậu tƣơng là loại cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tƣơng là loại rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. [...]... tiến hành nghiên cứu chuyển gen để tạo dòng cây kháng bệnh virus nhƣ cam, quýt, dƣa hấu… 1.3 VIRUS SMV VÀ HỆ GEN CỦA SMV Soybean Mosaic Virus (SMV) thuộc Chi Potyvirus, họ Potyviridae, là một trong những loại virus gây bệnh quan trọng nhất ở cây đậu tƣơng (Glycine max [L.] Merrill.) và bệnh khảm lá đậu tƣơng do SMV gây ra gặp ở hầu hết các quốc gia trên thế giới SMV có thể gây ra thiệt hại đáng kể về... nhất Bệnh khảm lá đậu tƣơng do virus SMV gây nên là một trong những bệnh quan trọng nhất ở nhiều nơi trên thế giới Mức độ của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu Ở nhiệt độ cao, bệnh không biểu hiện triệu chứng bệnh ra ngoài Bệnh đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên 90 Bệnh hiện diện ở khắp các vùng trồng đậu nành trên thế giới Khi bệnh xuất hiện sớm sẽ dẫn đến thất thu nặng Ở đồng... phƣơng pháp sinh học phân tử Bƣớc tiếp theo tiến hành phân lập gen hoặc một số vùng gen khác trong hệ gen của virus trên cơ sở thu thập thông tin về genome của virus, đặc biệt những thông tin của gen CP và một số gen trong hệ gen của virus, thiết kế các cặp mồi để nhân gen CP và một số gen khác, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen đích Trên cơ sở phân tích so sánh trình tự gen của các dòng... chƣa tới 30 ngày Ở Việt Nam, trong thập niên 60, bệnh vàng lá cam quýt đã hủy diệt nhiều vƣờn cam ở hầu hết các tỉnh trong cả nƣớc; cây bông, hồ tiêu, ca cao đều bị bệnh vàng lá gây hại, các loại cây nhƣ thuốc lá, khoai tây, cà chua, các cây họ đậu, các cây ăn quả đều bị nhiễm bệnh bệnh do virus gây nên [5] Không chỉ gây ra hiện tƣợng chết ngay hay từ từ ở cây trồng, virus còn ảnh hƣởng xấu đến phẩm... gần Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 10.000 bp Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HCpro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Viral genome-linked protein (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein. .. Capsid protein (CP) (Hình 1.1) Hình 1.1 Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV Won-Seok Lim và đtg (2003) đã phân tích trình tự nucleotide hoàn chỉnh của RNA genome của SMV chủng G5 (SMV- G5) và G7H (SMV- G7H) và so sánh với trình tự của các chủng SMV khác Mỗi RNA virus SMV dài 9588 nucleotide (chƣa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một polyprotein mà sau đó đƣợc phân cắt thành 10 protein. .. vector chuyển gen để chuyển vào thực vật tạo cây chuyển gen kháng virus tại Việt Nam là rất cần thiết Chu Hoàng Hà và đtg (2004) [6] đã phân tích tính đa dạng trên cơ sở so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP) của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam Tiếp đến là nghiên cứu sự đa dạng trong trình tự gen CP của virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua [13], của virus gây bệnh đốm của cây... potyvirus Protein vỏ (CP) do gen CP mã hóa đƣợc chia thành ba phần: đầu N, vùng cốt lõi và đầu C Gen Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 18 CP dài 807 bp, trong đó vùng mã hóa dài 804 bp [62] Protein của gen CP bao gồm 267 amino acid, trong đó vùng Poty-coat bắt đầu từ amino acid thứ 33 đến amino acid 264 đƣợc thể hiện ở hình 1.2 và hình 1.3 [62] Hình 1.2 Sơ đồ protein CP của SMV Hình... Virus gây bệnh không những làm giảm năng suất cây trồng mà còn làm giảm phẩm chất của sản phẩm Vì thế, bệnh do virus gây ra là loại bệnh gây hại toàn diện và rất nguy hiểm cho ngành trồng trọt ở nƣớc ta cũng nhƣ trên thế giới [5] 1.2.2 Bệnh do virus ở cây đậu tƣơng Bệnh trên cây đậu tƣơng xuất hiện là do nhiều nguyên nhân nhƣ : bệnh do sâu, do vi khuẩn hoặc virus… trong đó bệnh do virus thƣờng gây thiệt... (1898) [5] Đến đầu thế kỉ XX, các virus gây bệnh cho thực vật lần lƣợt đƣợc phát hiện nhƣ virus khảm dƣa chuột, virus khảm thuốc lá, virus khảm khoai tây, virus xoăn lá khoai tây, xoăn lá cà chua… Nhƣng mãi tới năm 1939, khi Pfankuch và Ryska sử dụng kĩ thuật hiển vi điện tử quan sát thấy virus khảm thuốc lá thì việc nghiên cứu và phát triển nhóm nguyên nhân gây bệnh này mới diễn ra nhanh chóng và thu . kháng bệnh. Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Phân lập đoạn gen mã hóa protein vỏ từ SMV (Soybean mosaic virus) gây bệnh khảm lá ở đậu tương . 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập và. tự gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina 43 Hình 3.10 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƢƠNG LY PHÂN LẬP ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ TỪ SMV (SOYBEAN