1 MỞ ĐẦU Đã từ lâu, hoa lan được cả thế giới ca ngợi là “Nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa lan đã chinh phục con người bởi cấu trúc kỳ diệu của đóa hoa cũng như bởi sự đa dạng về màu sắc, hình dạng và hương thơm quyến rũ của nó. Nhu cầu trồng và thưởng thức hoa lan của con người ngày càng tăng bởi vẻ đẹp và độ bền của hoa. Lan Hài Vệ nữ (Paphiopedilum sp.) với hình dạng độc đáo như ch iếc hài của phụ nữ và vẻ đẹp quý phái được coi là nhóm đặc sắc nhất trong họ lan. Đây là một trong những loài thực vật kiểng được ưu thích và có giá trị thương mại cao nhất trên thế giới. Không chỉ quý vì vẻ đẹp, lan Hài còn là một trong những loài thực vật hiếm nhất trên thế giới hiện nay. Là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam đư ợc các nhà khoa học xác định là một trong những cái nôi của loài lan Hài Vệ nữ với khoảng 20 loài, trong đó có nhiều loài có tính đặc hữu hẹp. Tuy nhiên, do sự khai thác ồ ạt thiếu kiểm soát và nạn phá rừng tràn lan, các loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Để bảo vệ nguồn gen quý này, Công ước quốc tế về buôn bán các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (CITES) đã cấm xuất khẩu các loài lan Hài của Việt Nam dưới mọi hình thức. Là loài lan Hài có tính đặc hữu rất hẹp, lan Hài Hồng (Paphi opedilum delenatii) là một trong các loài lan quý hiếm nhất của Việt Nam cũng như của thế giới. Được người Pháp phát hiện từ đầu thế kỷ 20, lan Hài Hồng đã nhanh chóng được ưa thích trên toàn thế giới bởi vẻ đẹp quý phái nhưng thanh nhã của nó. Do có giá trị thương mại cao và tính đặc hữu rất hẹp, độ mẫn cảm với môi trường cao mà lan Hài Hồng ngoài tự nhiê n đang trong tình trạng có nguy cơ tuyệt chủng trầm 2 trọng. Khác với lan Hài Hồng, Vân Hài (Paphiopedilum callosum) là một trong các loài lan Hài có khu vực phân bố rộng. Tuy vậy, do giá trị thương mại cao lại dễ khai thác do khu vực sống của loài lan này ở độ cao thấp, gần suối nên hiện nay Vân Hài ngoài tự nhiên cũng đang có nguy cơ tuyệt chủng. Với mong muốn góp phần bảo tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm nguyên liệu cho công tác tạo giống hai loài lan Hài quý hiếm này, chúng tôi thực hiện đề t ài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương pháp chiếu xạ”. 3 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương pháp chiếu xạ” là xác định quy trình nhân giống in vitro phục vụ bảo tồn và thương mại hai loài lan quý hiếm của Việt Nam và tạo ra các dòng biến dị in vitro bằng bức xạ ion hóa. ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN Quy trình nhân giống in vitro lan Hài Hồng (Paphi opedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) có ý nghĩa quan trọng đối với công tác bảo tồn hai loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam bên cạnh ý nghĩa thương mại của nó. Nghiên cứu tác động của bức xạ ion hóa đối với các loài lan này là cơ sở cho các nghiên cứu về chọn tạo giống lan Hài, góp phần phát triển đa dạng các giống lan Hài đặc hữu quý hiếm của Việt Nam. TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC - Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống in vitro hai loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum). - Khảo sát tác động của bức xạ ion hóa lên sự sinh trưởng và phá t triển của mẫu in vitro ở hai loài lan Hài nói trên. - Đã gây tạo và chọn lọc được các dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng (12 dòng) và Vân Hài (12 dòng); trong đó đã tiến hành khảo sát sự biến đổi di truyền ở mức phân tử của 5 dòng Vân Hài và 2 dòng Hài Hồng. MỤC LỤC Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Mở đầu…………….… ……………………………………………………… 1 Mục tiêu của đề tài……………………………………………………………… 3 Điểm mới của luận văn………………………………………………………… 3 Tóm tắt kết quả đạt được…………………………………………………………3 Chương I: Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan về cây lan Hài…………………………………………………….4 1.1.1 Phân loại………………………………………………………………… 4 1.1.2 Hình thái………………………………………………………………… 5 1.1.3 Sinh thái………………………………………………………………… 8 1.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam………………………………………….9 1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vâ n Hài…………………………………….12 1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)……… ………………………….12 1.1.5.2 Vân Hài (Paphiopedilum callosum)…………………………………… 13 1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật………………………………………………15 1.2.1 Môi trường nuôi cấy mô thực vật……………………………………… 16 1.2.1.1 Các loại muối khoáng………………………………………………… 16 1.2.1.2 Vitamin………………………………………………………………….17 1.2.1.3 Chất điều hòa sinh trưởng……………………………………………….17 1.2.1.4 Các chất bổ sung……………………………………………………… 18 1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất………….19 1.3 Tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chiếu xạ………………………20 1.3.1 Đột biến và phân loại đột biến………………………………………… 20 1.3.2 Các tác nhân gây đột biến……………………………………………… 21 1.3.2.1 Tác nhân vật lý………………………………………………………… 22 1.3.2.2 Tác nhân hóa học……………………………………………………… 23 1.3.3 Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống……………………………24 1.3. 4 Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng trong tạo giống cây trồng………………………….…………………… 25 1.4 Chọn lọc dòng biến dị……………………………………………………….29 1.4.1 Chọn lọc dựa trên karyotype của thực vật……………………………….30 1.4.2 Kỹ thuật PCR…………………………………………………………….31 1.4.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR……………………………………………… 31 1.4.2.2 Quy trình kỹ thuật PCR………………………………………………….32 1.4.2.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR…………………………………………….32 1.4.2.4 Các hạn chế của kỹ thuật PCR………………………………………… 34 1.4. 2.5 Kỹ thuật phân tích tính đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD)……………………………….…………………… 34 Chương II: Vật liệu và phương pháp 2.1 Vật liệu………………………………………………………………………37 2.2 Các phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 38 2.2.1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu…………………………………… 38 2.2.2 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài………………………… 39 2.2.2.1 Khảo sát môi trường hình thành callus của lan Hài…………………… 39 2.2.2.2 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB………………………………… 41 2.2.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi………………………………… 43 2.2.2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro………………………….45 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên mẫu lan Hài in vitro………….46 2.2.3.1 Chiếu xạ mẫu……………………………………………………………47 2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau chiếu xạ………………………………… 47 2.2.3.3 Tạo và xác định các dòng biến dị.………………………………………48 2.2.4 Chọn lọc sau chiếu xạ…………………………………………………… 48 2.2. 4.1 Chọn lọc cây có biểu hiện khác biệt về kiểu hình trong nuôi cấy in vitro……….……………………………………………… 48 2.2.4.2 Kiểm tra sự biến đổi di truyền………………………………………… 49 2.2.5 Xử lý thống kê số liệu…………………………………………………… 51 Chương III: Kết quả và thảo luận 3.1 Khảo sát điều kiện khử trùng và nuôi cấy mô lan Hài………………………52 3.1.1 Điều kiện khử trùng mẫu………………………………………………….52 3.1.2 Khảo sát môi trường tạo callus……………………………………………53 3.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB…………………………………….56 3.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi …………………………………….58 3.1.5 Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh……………………………… 60 3.2 Chiếu xạ tạo các dòng biến dị lan Hài trong điều kiện in vitro……………….61 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chiếu xạ tia gamma và chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro 61 3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ gamma đối với mẫu lan Hài 62 3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro 65 3.2.2 Tạo dòng biến dị… 66 3.3 Chọn lọc các dòng biến dị in vitro 69 3.3.1 Chọn lọc kiểu hình 69 3.3.2 Chọn lọc dựa trên chất liệu di truyền 72 3.3. 2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 75 3.3.2.2 Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD 77 Chương IV: Kết luận và đề nghị 4.1 Kết luận… 83 4.2 Đề nghị 84 Tài liệu tham khảo 86 Phụ lục DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)……… …………………… 10 Bảng 2.1 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo callus 40 Bảng 2.2 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB……42 Bảng 2.3 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi… ………………………………………………… … 44 Bảng 2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro………… … 45 Bảng 2. 5 Tên và trình tự các đoạn mồi………………………….………………50 Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng 6 tuần……….52 Bảng 3.2 Tình trạng hạt lan Hài sau khử trùng và gieo hạt 10 tuần……….…….53 Bảng 3.3 Khả năng tạo callus từ PLB………………………………………… 55 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB……………….…57 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi của lan Hài…… 58 Bảng 3.6 Khả năng tái sinh hoàn chỉnh của câ y lan Hài……………………… 60 Bảng 3.7 Giá trị LD 50 của các mẫu lan Hài Hồng và Vân Hài……………… 65 Bảng 3.8 Khả năng biến dị của cây lan Hài sau khi chiếu xạ tia gamma.………67 Bảng 3.9 Các dạng biến dị in vitro của cây lan Hài sau khi chiếu xạ chùm ion 68 Bảng 3.10 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Hài Hồng chiếu xạ chùm ion (mẫu phân tích DNA)……………………………… 73 Bảng 3.11 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Vân Hài chiếu xạ chùm ion (mẫu phân tích DNA)……………………………………….…………….74 Bảng 3.12 Kết quả tách chiết DNA của các dòng lan Hài biến dị và mẫu đối chứng dùng trong kỹ thuật RAPD … ………………76 Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD lan Hài Hồng 78 Bảng 3.14 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Hài Hồng…………… 78 Bảng 3.15 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD lan Vân Hài …………………… 80 Bảng 3.16 Hệ số tương đồng di truyền của cá c dòng Vân Hài …………….… 81 Bảng 3.17 Tỉ lệ sống của mẫu PLB và chồi lan Hài sau chiếu xạ 2 tháng và 4 tháng………………………… … phụ lục Bảng 3.18 Tỉ lệ sống của mẫu cây lan Hài sau chiếu xạ 4 tháng………… phụ lục DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số loài lan Hài của Việt Nam………………………………………7 Hình 1.2 Lan Hài Hồng……………………………………………………….…12 Hình 1.3 Lan Vân Hài………………………………………………………… 14 Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật RAPD………………………………………………….35 Hình 2. Quy trình thực hiện thí nghiệm…………………………………………46 Hình 3.1 Mẫu lan Hài in vitro ở các giai đoạn khác nhau………………………59 Hình 3.2 Mẫu PLB và chồi lan Hài chết sau chiếu xạ………………………… 62 Hình 3.3 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu lan Hài Hồng in vitro… 63 Hình 3.4 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu lan Vân Hài in vitro… 64 Hình 3. 5 Các dạng biến dị ở cây Hài Hồng bởi chùm ion…………………… 70 Hình 3.6 Các dạng biến dị ở cây Vân Hài bởi chùm ion…………………… …71 Hình 3.7 Các dòng biến dị lan Hài Hồng thế hệ M 1 V 2 (mẫu phân tích DNA) 72 Hình 3.8 Các dòng biến dị lan Vân Hài thế hệ M 1 V 2 (mẫu phân tích DNA) 72 Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu DNA lan Hài 75 Hình 3.10 So sánh ba dòng lan Hài Hồng ở mức độ phân tử 79 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD với các primer OPD5 và OPD6 của 6 dòng lan Vân Hài…… …… 79 Hình 3.12 So sánh năm dòng lan Vân Hài ở mức độ phân tử……………… …81 Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Hài Hồng……………… phụ lục Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Vân Hài…………………phụ lục [...]... thuật gây tạo vết thương, sử dụng phương pháp nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân (Dương Tấn Nhựt, 2007); Nhân giống in vitro và tạo đột biến (Lê Quang Luân, 2007); Nhân giống lan Hài Hằng (Paphiopedilum hangianum) và Hài Tam Đảo (Paphiopedium gratrixianum) (Viện Ứng dụng Công nghệ, 2009); Lai tạo giống lan Hài (Trần Phạm Anh Tuấn, 2009) 12 1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vân Hài 1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum. .. nước nghiên cứu nhằm mục đích nhân giống vô tính như: Nuôi cấy chồi và chóp lá (Allenberge, 1976); Kích thích tạo chồi bên và cây con (Nieman, 1980; Sampolinski, 1983; Stewart & Button, 1977); Phân lập tế bào trần của các loài lan Hài (Price & Earl, 1984); Nuôi cấy mô sẹo (Lin, 2000); Tạo dòng lan Hài in vitro (Huang, 2001); Tái sinh cây lan Hài từ nuôi cấy lá (Cheng et al, 2004); Nhân giống vô tính bằng. .. delenatii) Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii Guillaum) là một trong những loài đặc hữu hẹp nhất của Việt Nam [1] Với vẻ đẹp đặc sắc của hoa và cả lá cây, lan Hài Hồng hiện nay là một trong các loài hoa được ưa chuộng và có giá trị kinh tế cao trên thị trường cây cảnh thế giới Hình 1.2 Hài Hồng Lan Hài Hồng được phát hiện lần đầu từ khoảng năm 1922 do một nhà điều tra người Pháp tên là Poilane ở gần... chứng minh bằng thực 28 nghiệm là phương pháp có giá trị để tạo ra các đột biến mong muốn và nhân giống nhanh, đặc biệt là ở thực vật [6],[12],[21] Các nghiên cứu về gây tạo đột biến trên thực vật cho thấy các cơ quan sinh dưỡng mẫn cảm hơn hạt khô hay hạt đang ngủ nghỉ Tế bào thực vật có khả năng phân hóa thành cơ thể mới nên những đột biến gây tạo trong nuôi cấy in vitro có thể được nhân lên bằng sinh... sinh dưỡng [12] Đầu những năm 1990, những nghiên cứu về đột biến gây tạo bằng chiếu xạ trên mẫu in vitro được tiến hành trên chuối và khoai tây Hiện nay, kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi trên những cây trồng nhân giống vô tính khác như lúa, cúc, đậu, lê, cẩm chướng [6],[12] Các nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng bằng phóng xạ cho thấy, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu tạo. .. hành ở mức tế bào Cây tái sinh mang tính trạng di truyền mới, ít xuất hiện thể khảm Điều này đã rút ngắn đáng kể thời gian chọn lọc và hạn chế các biến dị soma trên thực vật khi tiến hành tạo giống [3] Đồng thời, các nghiên cứu cũng cho thấy xử lý đột biến các mô nuôi cấy cho tần suất biến dị cao hơn, vì tế bào được tiếp xúc trực tiếp với các tác nhân gây đột biến 1.3 TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG MỚI BẰNG PHƯƠNG... không nảy mầm) Nhiều nghiên cứu về đột biến cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về bản chất giữa các đột biến nhân tạo và đột biến tự nhiên Các dạng đột biến trong tự nhiên đều thấy xuất hiện trong các phổ đột biến nhân tạo Điều khác biệt cơ bản giữa hai dạng đột biến này là tần số đột biến Các nghiên cứu cũng cho thấy tần số đột biến do xử lý bằng bức xạ cao hơn tần số đột biến tự nhiên khoảng... ở phía sau núm nhụy và hai bên cuốn cột Bầu dưới, một ô, đính noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn - Quả: dạng quả nang, khô, dài, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt Quả chin trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng 7 Lan Hài Đài cuộn lan Hài Đốm lan Hài Hồng (P appletonianum) (P concolor) (P delenatii) Lan Hài Lông lan. .. cả các môi trường đều có Thiamin (Vitamin B1) Các Vitamin thường dùng là: Myo-inositol, nicotinic acid (Vitamin PP), Pyridoxine HCl (Vitamin B6)… 1.2.1.3 Chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực... tác nhân gây đột biến - Hàng chục dòng biến dị tiềm năng có thể được chọn lọc nhanh chóng chỉ sau một vài thế hệ, ít tốn kém, tốc độ tạo dòng thuần nhanh [6],[12] Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có một vài hạn chế: - Môi trường nuôi cấy in vitro có thể làm xuất hiện một vài biến dị dạng thường biến xuất hiện do lỗi khi dịch mã DNA làm ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc và tạo dòng đột biến