ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    TRẦN VĂN PHƯƠNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG ARACHIS HYPOGAEA L., HỌ ĐẬU (FABACEAE), ĐỊNH HƯỚNG TÌM KIẾM SỰ HIỆN DIỆN CỦA RESVERATROL Chuyên ngành : Hóa Hữu Cơ Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TÔN THẤT QUANG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2012 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Cô GS. TS. Nguyễn Kim Phi Phụng và Thầy TS. Tôn Thất Quang đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, quan tâm và động viên em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Thầy PGS. TS. Trương Thế Kỷ, Cô PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hạnh, thầy TS. Nguyễn Trung Nhân đã nhận lời tham gia Hội đồng, phản biện, đóng góp ý kiến để em hoàn thành luận văn. Tất cả các quí Thầy, Cô trong khoa Hóa, đặc biệt là các Thầy, Cô trong bộ môn Hóa Hữu cơ đã giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho em trong lúc học tập tại trường. Các anh chị nghiên cứu sinh, học viên cao học các khóa trước, các bạn cùng khóa K18 và các em sinh viên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Và cuối cùng tôi muốn tỏ lòng biết ơn đến các thành viên trong gia đình tôi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn này Xin chân thành cảm ơn. MỤC LỤC Danh mục các hình vẽ Danh mục các sơ đồ và bảng biểu Danh mục các từ viết tắt và kí hiệu MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẶC TÍNH THỰC VẬT 2 1.1.1. Giới thiệu về họ Đậu (Fabaceae) 2 1.1.2. Giới thiệu chi Arachis 2 1.1.3. Giới thiệu về cây đậu phộng 5 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH RESVERATROL 5 1.2.1. Giới thiệu resveratrol 5 1.2.2. Tác dụng đề phòng bệnh tim mạch của resveratrol 6 1.2.3. Tác dụng kháng khối u của resveratrol 7 1.2.4. Tác dụng đối với viêm khớp của resveratrol 8 1.2.5. Tác dụng phòng bệnh tiểu đường của resveratrol 8 1.2.6. Tác dụng chống lão hóa của resveratrol 8 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CÂY ĐẬU PHỘNG 8 1.4. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 9 1.4.1. Hàm lượng resveratrol trong cây đậu phộng 9 1.4.2. Một số hợp chất được cô lập từ cây đậu phộng 9 Chương 2. THỰC NGHIỆM 13 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13 2.1.1. Hóa chất 13 2.1.2. Thiết bị 13 2.2. TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TỪ RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG – ARACHIS HYPOGAEA 14 2.2.1. Điều chế các loại cao 14 2.2.2. Cô lập một số hợp chất hữu cơ 14 2.3. ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL TỪ CÂY ĐẬU PHỘNG – ARACHIS HYPOGAEA 15 2.3.1. Điều chế các loại cao 15 2.3.2. Phân tích các loại cao 15 Chương 3. NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 16 3.1. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 16 3.1.1. Thu hái và xử lí mẫu 16 3.1.2. Xác định độ ẩm 16 3.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 17 3.2.1. Điều chế cao các loại cao từ rễ để khảo sát thành phần hóa học 17 3.2.2. Điều chế các mẫu cao để định lượng resveratrol 20 3.3. LY TRÍCH, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY ARACHIS HYPOGAEA 21 3.3.1. Cô lập hợp chất từ cao cloroform 21 3.3.2. Cô lập hợp chất từ cao etyl acetate 22 3.3.3. Cô lập hợp chất từ cao metanol 1 23 3.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ CÔ LẬP ĐƯỢC 28 3.4.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất HYPO 1 28 3.4.2. Hợp chất HYPO 2 31 3.4.3. Hợp chất HYPO-3 32 3.4.4. Hợp chất HYPO-4 33 3.4.5. Hợp chất HYPO-5 36 3.4.6. Hợp chất HYPO-6 38 3.4.7. Hợp chất HYPO-7 43 2.4.8. Hợp chất HYPO-8 48 3.5. ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL 52 Chương 4. KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Cây đậu phộng - Arachis hypogaea (1 tháng tuổi) 3 Hình 1.2. Cây đậu phộng - Arachis hypogaea (2 tháng tuổi) 3 Hình 1.3. Cây đậu phộng - Arachis hypogaea (3 tháng tuổi) 4 Hình 3.1. Sắc ký lớp mỏng các loại cao điều chế được theo Sơ đồ 3.1 19 Hình 3.2. Sắc ký lớp mỏng các hợp chất cô lập được trong rễ cây đậu phộng - Arachis hypogaea 28 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU Trang Sơ đồ 3.1. Qui trình điều chế các loại cao từ rễ cây đậu phộng - Arachis hypogaea bằng phương pháp trích pha rắn trên silica gel 18 Sơ đồ 3.2. Qui trình điều chế các loại cao của rễ, thân, lá cây đậu phộng - Arachis hypogaea để định lượng resveratrol 20 Bảng 1.1. Hàm lượng resveratrol trên vỏ hạt ở một số giống cây đậu phộng 10 Bảng 1.2. Hàm lượng resveratrol trên rễ ở một số giống cây đậu phộng 10 Bảng 3.1. Khối lượng và thu suất các loại cao thu được so với cao thô etanol ban đầu (120 g) 17 Bảng 3.2. Sắc ký cột silica gel trên cao cloroform ( 17 g) 25 Bảng 3.3. Sắc ký cột silica gel trên cao etyl acetate (15,3 g) 26 Bảng 3.4. Sắc ký cột silica gel trên cao metanol 1 (15,0 g). 27 Bảng 3.5. So sánh phổ NMR của HYPO 1 với acid ursolic 30 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của HYPO 2 với kaempferol 32 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của HYPO 3 với β-sitosterol 3-O-β-D- glucopyranoside 35 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của HYPO 4 với resveratrol 36 Bảng 3.9. So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 5 với quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside 38 Bảng 3.10. So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 6 với (2S,3S,4R,2’R,8Z)- 1-O-β-D-glucopyranosyl-2-(2-hydroxyhexadecanoylamino) octadeca-8-en-1,2,4-triol 41 Bảng 3.11. So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 7 với soyasapogenol B 46 Bảng 3.12. So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 8 với soyasapogenol E 50 Bảng 3.13. Định lượng resveratrol 52 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT S : mũi đơn (singlet) br d : mũi đôi rộng (broad doublet) br s : mũi đơn rộng (broad singlet) D : mũi đôi (doublet) dd : mũi đôi - đôi (doublet-doublet) dt : mũi đôi ba (doublet of triplet) T : mũi ba (triplet) M : mũi đa (multiplet) J : hằng số ghép (coupling constant) RP-18 : R eversed P hase C-18 STT : số thứ tự SKLM : sắc ký lớp mỏng HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HR-MS : khối phổ độ phân giải cao (High Resolution – Mass Spectroscopy) NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC : tương quan H-C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Coherence) HMBC : tương quan H-C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) COSY : phổ tương quan giữa proton-proton ( CO rrelation S pectroscop Y ) NOESY : N uclear O verhauser E nhancement S pectroscop Y DMSO : D i M etyl S ulf O xid Arachis hypogaea Tổng quan Trang 1 MỞ ĐẦU Trong đời sống con người, các loại cây cỏ trong tự nhiên có một vị trí và vai trò hết sức quan trọng, đặc biệt có nhiều loài đã được sử dụng trong dân gian để làm thuốc chữa bệnh từ rất lâu. Vì thế, việc khảo sát thành phần hóa học của những loài cây có giá trị trong tự nhiên là một công việc rất quan trọng và có ý nghĩa thực tiễn. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm, gió mùa, rất thích hợp cho sự sinh trưởng của thực vật, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú. Đó là điều kiện rất thuận lợi cho việc khảo sát thành phần hóa học của các loài cây cỏ có ích trong tự nhiên. Các nhà khoa học phát hiện hợp chất resveratrol – thành phần của rượu vang đỏ và vỏ nho, có thể làm chậm quá trình lão hóa, phòng bệnh tim mạch, ung thư….Từ vỏ nho, các dược sĩ đã bào chế được loại thực phẩm chức năng chứa resveratrol dùng để phòng ngừa các bệnh kể trên. Tuy nhiên, vỏ nho thu được từ trái nho không nhiều, tương đối đắt nên giá thành sản xuất cao. Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện được resveratrol từ rễ cây đậu phộng. Ngoài ra cây đậu phộng (Arachis hypogaea) còn có nhiều ứng dụng trong thực tiễn như: hạt chữa ho sốt đờm, chữa đại tiện táo kết, giúp người bệnh mới khỏi sút cân và phụ nữ ít sữa, phụ nữ ho lâu…Phát hiện gần đây nhất là rễ có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa, ngăn ngừa bệnh tim mạch, tăng huyết áp và bệnh ung thư…. Đề tài nghiên cứu của tôi tập trung vào : ‘‘KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG ARACHIS HYPOGAEA, ĐỊNH HƯỚNG TÌM KIẾM SỰ HIỆN DIỆN CỦA RESVERATROL’’, với hy vọng góp phần thêm một hướng mới trong bào chế dược phẩm, có thể giá thành sản phẩm sẽ hạ do rễ cây đậu phộng giá thành thấp. Arachis hypogaea Tổng quan Trang 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC TÍNH THỰC VẬT 1.1.1. Giới thiệu về họ Đậu (Fabaceae) [1,2] Họ Đậu (Fabaceae) là họ lớn thứ hai của thực vật có hoa với 650 chi và trên 18.000 loài. Các tên gọi thông thường chủ yếu của các loài trong họ này là Đỗ hay Đậu và họ này chứa một số loài cây quan trọng bậc nhất trong cung cấp thực phẩm cho con người. Tất cả các thành viên trong họ này đều có hoa chứa 5 cánh hoa, trong dó bầu nhụy lớn khi phát triển được sẽ tạo ra quả thuộc loại quả đậu, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ. Các loài trong họ này theo truyền thống được phân loại trong ba phân họ: • Phân họ Vang (Caesalpinioideae), hay họ Vang (Caesalpiniaceae) • Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), hay họ Trinh nữ (Mimosaceae) • Phân họ Đậu (Faboideae hay Papilionoideae) (họ Fabaceae nghĩa hẹp hay họ Papilionaceae). Giá trị kinh tế: Nguồn cây làm rau quan trọng, cây làm thuốc, cây làm thức ăn gia súc, cây làm cảnh và cây cải tạo đất. 1.1.2. Giới thiệu chi Arachis Arachis [2,10] là một chi của khoảng 70 loài thực vật của họ Đậu (Fabaceae), có hoa sống một năm hoặc lâu năm, và có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ. Có một loài với tên gọi là lạc hay đậu phộng (Arachis hypogaea), có giá trị như một loài cây cung ứng lương thực có tầm quan trọng toàn cầu; một vài loài khác được trồng với quy mô nhỏ tại Nam Mỹ. [...].. .Arachis hypogaea Trang 3 Hình 1.1: Cây đậu phộng ̶ Arachis hypogaea (1 tháng tuổi) Hình 1.2: Cây đậu phộng ̶ Arachis hypogaea (2 tháng tuổi) Tổng quan Arachis hypogaea Trang 4 Tổng quan Hình 1.3: Cây đậu phộng ̶ Arachis hypogaea (3 tháng tuổi) Arachis hypogaea Trang 5 Tổng quan 1.1.3 Giới thiệu về cây đậu phộng Lạc, Ðậu phộng - Arachis hypogaea L Đậu phộng hay đậu phụng, còn gọi là lạc, tên khoa học:... sự phát hiện lại của resveratrol, do Arichi của đại học y khoa Aichi-Nhật phân tích từ cây Polygonum cuspidatum thu được thành phần hữu hiệu giảm huyết áp Cho nên tác dụng giảm huyết áp của resveratrol là không thể nghi ngờ [40] Viện y học của Đại học Quốc lập Đài Loan vào năm 2002 đã chứng minh resveratrol có thể bảo vệ tim [41] 1.2.3 Tác dụng kháng khối u của resveratrol Kể từ năm 1992 khi phát hiện. .. 1992 nhân viên nghiên cứu của đại học Cornell Mỹ đã tìm thấy resveratrol trong rượu vang, thì mới xem như là tìm thấy “chúa cứu thế” [35] Tuy rằng người Nhật nghiên cứu thành phần hóa học của cây Polygonum cuspidatum [37] sớm hơn so với nghiên cứu hàm lượng resveratrol trong rượu vang của đại học Cornell, nhưng lúc bấy giờ không gây nhiều sự chú ý Chỉ đến khi người Mỹ phát hiện resveratrol trong rượu... DƯỢC TÍNH CÂY ĐẬU PHỘNG [12] Cây đậu phộng (Arachis hypogaea) thuộc chi Arachis, họ Đậu (Fabaceae) có nhiều ứng dụng trong thực tiễn như: hạt chữa ho sốt đờm, chữa đại tiện táo kết, người bệnh mới khỏi sút cân và phụ nữ ít sữa, phụ nữ ho lâu…Phát hiện gần đây nhất là trong cây đậu phộng có chứa resveratrol có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa, ngăn ngừa Trang 9 Arachis hypogaea Tổng quan bệnh tim mạch,... thể nói nếu sử dụng resveratrol lâu dài hoàn toàn có thể làm cho vết thương viêm khớp hoàn toàn bình phục [44] 1.2.5 Tác dụng phòng bệnh tiểu đường của resveratrol Năm 2006 là mốc phát triển quan trọng trong giới khoa học, phát hiện tác dụng kháng bệnh tiểu đường tuýp II của resveratrol Khi giáo sư Sinclair của đại học Harvard nghiên cứu chức năng kháng lão hóa của resveratrol, phát hiện con chuột ăn... ung thư… 1.4 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 1.4.1 Hàm lượng resveratrol trong cây đậu phộng Năm 2000, Timothy H Sanders và cộng sự [19] đã khảo sát hàm lượng resveratrol trong vỏ hạt đậu ở một số giống cây đậu phộng ở các nước Kết quả được trình bày trong bảng 1.1 Năm 2002, R S Chen, P L Wu and Robin Y Chiou [20] đã khảo sát hàm lượng resveratrol trong rễ ở một số giống cây đậu phộng ở Taiwan Kết quả được trình... các hợp chất: HYPO 4, HYPO 5, HYPO 6 Arachis hypogaea Trang 15 Thực nghiệm Sắc ký điều chế trên cao metanol 1 thu được các hợp chất: HYPO 7, HYPO 8 Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, thuốc thử hiện hình dung dịch H2SO4 30%, đèn UV 2.3 ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL TỪ CÂY ĐẬU PHỘNG – ARACHIS HYPOGAEA 2.3.1 Điều chế các loại cao Rễ, thân, lá cây đậu phộng được thu hái tại Bến Tre ở các... 0,022 Runner Florispan C3 0,022 ± 0,014 Bảng 1.2: Hàm lượng resveratrol trong rễ ở một số giống cây đậu phộng [20] Loại giống Mùa Thu 2000 Mùa Xuân 2001 Resveratrol (µg/g) Tainan 9 554 ± 225 27 ± 12 Tainan 11 620 ± 408 31 ± 2 Tainan 12 905 ± 311 37 ± 2 Trang 11 Arachis hypogaea Tổng quan Cấu trúc hóa học của một số hợp chất được cô lập từ cây đậu phộng OH OH 3' 2' 8 HO O 9 1' 2 6' 7 4 10 5 3 6'' O O HO... thực vật, đa số là những thức ăn thường gặp, bao gồm nho (rượu), đậu phộng, dứa, dâu… Có thể nói dược tính tốt của resveratrol đếm không hết Chức năng của nó khi mới phát hiện là có thể giúp giảm mỡ máu, trị chứng cao huyết áp; sau đó phát hiện có thể ức chế sự động tụ khác thường của tiểu cầu (chống tắc động mạch), làm rộng mạch máu, cải thiện vi tuần hoàn; nó có thể giúp đề phòng bệnh động mạch vành,... trình điều chế cao được thực hiện theo qui trình trình bày ở sơ đồ 3.2 RỄ, THÂN, LÁ • Sấy khô, xay nhuyễn TỪNG BỘ PHẬN (50 g) Đun hoàn lưu, với etanol: nước (8:2) (500 ml x 5 lần, mỗi lần 1 giờ) • Lọc, cô quay thu hồi dung môi • CAO ETANOL − NƯỚC (1–2 g) Sơ đồ 3.2 Qui trình điều chế các loại cao của rễ, thân, lá cây đậu phộng - Arachis hypogaea để định lượng resveratrol Arachis hypogaea Trang 21 Nghiên . Arachis hypogaea Tổng quan Trang 5 1.1.3. Giới thiệu về cây đậu phộng L c, Ðậu phộng - Arachis hypogaea L. Đậu phộng hay đậu phụng, còn gọi l l c, tên khoa học: Arachis hypogaea L. ,. N 1 ,N 5 ,N 10 - tri-p-(E,E,E)-coumaroylspermidine, quercetin 3-glucoside, quercetin 3-glucoronide, isorhamnetin 3-glucoside, isorhamnetin 3-glucoronide từ hoa cây đậu phộng. Năm 200 9, Yu-Young Lee. đậu phộng ̶ Arachis hypogaea (1 tháng tuổi) Hình 1.2: Cây đậu phộng ̶ Arachis hypogaea (2 tháng tuổi) Arachis hypogaea Tổng quan Trang 4 Hình 1.3 : Cây đậu phộng ̶ Arachis hypogaea