BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI CHU THỊ QUỲNH DIỆP NGHIÊN CỨU KIỂU GEN SSR VÀ CÁC TÍNH TRẠNG KINH TẾ CỦA TẬP ðOÀN NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học : TS. ðẶNG XUÂN NGHIÊM HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác. Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Học viên Chu Thị Quỳnh Diệp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới TS. ðặng Xuân Nghiêm, người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Nguyễn Ngọc Hòa, Ks. Nguyễn Ngọc Chỉnh, Ks. Nguyễn Khắc Hải, Ks. ðỗ Hải Quỳnh ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ñã tạo mọi ñiều kiện và giúp ñỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè, những người thân ñã luôn bên tôi, ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 02 tháng 04 năm 2013 Học viên Chu Thị Quỳnh Diệp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH Error! Bookmark not defined. PHẦN I: MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu 3 1.2.1.Mục ñích 3 1.2.2. Yêu cầu 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu chung về nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 4 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại 4 2.1.2. ðặc ñiểm chính của nấm men 6 2.2. Vai trò của nấm men trong sản xuất rượu 14 2.3. Giới thiệu về simple sequence repeats (SSRs) 15 2.3.1. Khái niệm 15 2.3.2. Phân loại SSRs 16 2.3.3. Phân bố của SSRs 16 2.3.4. Các phương pháp phát hiện các trình tự SSRs 17 2.3.5. Phân tích trình tự SSRs 18 2.3.6. Vai trò của SSRs 18 2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của ñề tài 20 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Vật liệu 23 3.1.1. ðối tượng nghiên cứu 23 3.1.2. Thiết bị 24 3.2. Môi trường 26 3.3. Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 27 3.3.1. Thời gian 27 3.3.2. ðịa ñiểm 27 3.4. Nội dung nghiên cứu 27 3.4.1. Thống kê toàn bộ các locus SSR của S. cerevisiae 27 3.4.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 27 3.4.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 27 3.5. Phương pháp nghiên cứu 28 3.5.1. Thống kê toàn bộ các locus SSRs của S. cerevisiae 28 3.5.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 28 3.5.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 29 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Thống kê toàn bộ các locus SSR của S. cerevisiae 34 4.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 39 4.2.1. Thiết kế mồi cho các locus SSR tiềm năng 39 4.2.2. Khảo sát sự ña hình của 15 locus SSR tiềm năng 41 4.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 45 4.3.1. Khảo sát ñặc ñiểm hình thái của các isolate nấm men 45 4.3.2. Sự sinh trưởng theo mật ñộ quang của các isolate nấm men 50 4.3.3. Khả năng tạo sinh khối của các isolate nấm men 55 4.3.4. Khả năng chịu cồn của các isolate nấm men 56 4.3.5. Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của các isolate nấm men 59 4.3.6. Khả năng chịu lạnh của các isolate nấm men 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4.3.7. Khả năng chịu khô hạn của các isolate nấm men 63 4.3.8. Khả năng lên men rượu của các isolate nấm men trên môi trường dịch chiết ñu ñủ 67 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 5.1. Kết luận 70 5.2. ðề nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 81 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Cs. Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid ISSR Inter-Simple Sequence Repeat (ñoạn giữa của các trình tự lặp lại ñơn giản) NST Nhiễm sắc thể OD Optical density (mật ñộ quang) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PGA Poly-γ-Glutamate PIC Polymorphism information content (hệ số ña dạng từng locus gene) S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SSRs Simple sequence repeats (trình tự lặp lại ñơn giản) T m Melting Temperature (nhiệt ñộ nóng chảy) T o Thời ñiểm bắt ñầu TS Tiến sĩ YPD Yeast peptone dextrose Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Danh sách 40 isolate nấm men ñược sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 2. Các thiết bị sử dụng trong ñề tài 25 Bảng 3. Các hoá chất sử dụng trong ñề tài 26 Bảng 4. Phân bố của SSR trên từng NST của nấm men Saccharomyces cerevisiae 34 Bảng 5. 15 cặp mồi SSR sử dụng ñể nghiên cứu sự ña hình các locus SSR ở nấm men (S. cerevisiae). 40 Bảng 6. Sự ña dạng di truyền của 15 locus SSR ở nấm men 41 Bảng 7. ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các isolate nấm men. 46 Bảng 8. Năng suất rượu và pH của dịch lên men rượu từ nấm men trên môi trường dịch chiết ñu ñủ sau 3 ngày lên men 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Một tế bào nấm men ñang mọc chồi. Cell wall (thành tế bào), Nucleus (nhân), Mitochondria (ty thể), Vacuole (không bào), spindle (ñiểm mọc chồi). 6 Hình 2.2. Các tế bào nấm men và cấu tạo bên trong tế bào. A: Hình ảnh các tế bào nấm men S. cerevisiae; B: Cấu tạo bên trong tế bào nấm men. 7 Hình 2.3. Chu kỳ sống của nấm men. 9 Hình 4.1. Phân loại các trình tự SSR ở nấm men theo dạng lặp. 35 Hình 4.2. Phân loại SSR nấm men theo mức ñộ hoàn hảo. 36 Hình 4.3. Phân loại SSR ở nấm men dựa theo chiều dài ñoạn lặp 38 Hình 4.4a. Sản phẩm PCR nhân dòng locus SCI.4.1 42 Hình 4.4b. ðiện di sản phẩm SSR-PCR với mồi SCVI.1.3 43 Hình 4.5. Sơ ñồ hình cây về mức ñộ tương ñồng di truyền dựa trên 15 trình tự SSR của 40 isolate nấm men. Thang trục hoành chỉ hệ số tương ñồng (coefficient). 44 Hình 4.6. Sinh trưởng của các isolate nấm men ở 30ºC 53 Hình 4.7. Sinh khối của các isolate nấm men nghiên cứu 55 Hình 4.8. Khả năng chịu cồn của nấm men tại nồng ñộ cồn 10%. 58 Hình 4.9. Khả năng chịu áp suất thẩm thấu của nấm men tại nồng ñộ ñường 15%. .60 Hình 4.10. Khả năng chịu ñông ñá và làm tan. Sau khi ñược ñóng băng ở - 20ºC trong 19 giờ, các mẫu ñược làm tan trong nước ở nhiệt ñộ phòng và ñược nuôi trong môi trường YPD lỏng. Tỷ lệ sống sót của chủng ñối chứng là 100%. 62 Hình 4.11. Khả năng chịu khô hạn của các isolate nấm men ở 30ºC, ñộ ẩm 75% 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 PHẦN I: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Nấm men có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, lên men rượu bia, bánh mì, protein ñơn bào, làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi, vi sinh vật probiotics có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cho người và vật nuôi, v.v. Có thể nói nó là vi sinh vật quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm và ñồ uống có cồn. Nấm men cũng là vi sinh vật nhân chuẩn ñơn bào (Eukaryote) ñược sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh học tế bào, sinh học phân tử, di truyền học, v.v. Chính vì vậy, nấm men là sinh vật nhân chuẩn ñầu tiên ñược giải trình tự toàn bộ genome vào năm 1996. S. cerevisiae ở thể lưỡng bội chứa 16 cặp nhiễm sắc thể, có kích thước khác nhau từ 200 – 2.200 kb. So với các sinh vật nhân chuẩn ña bào khác nấm men có khoảng trên 6000 gen khác nhau mã hoá cho tất cả các phân tử protein ñược tổng hợp trong tế bào và nấm men có bộ gen rất nhỏ gọn (Dujon, 1996). Các chủng nấm men khác nhau với kiểu hình và ñặc tính lên men khác nhau ñã sớm ñược nhận ra bởi các nhà sản xuất rượu bia và làm bánh mỳ, trước khi chúng ñược phân biệt bởi các nhà di truyền học. S. cerevisiae không chỉ ñược sử dụng ñể lên men bánh mỳ mà nó còn ñược sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm như ñể lên men bia, lên men rượu, sử dụng trong sản xuất rượu vang và sâmpanh, v.v. (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2001); trong y học, như việc dùng S. cerevisiae ñể sản xuất insulin chữa bệnh tiểu ñường, hay mới gần ñây người ta nghiên cứu sử dụng nấm men ñể sản xuất văc-xin viêm gan B (Nguyễn Thị Phương Trang và cs., 2007). Càng ngày người ta càng tìm ra nhiều ứng dụng của S. cerevisiae ñể phục vụ cho cuộc sống của con người. Trên thế giới, nghiên cứu ứng dụng nấm men bắt ñầu bằng việc phân lập, phân loại, chọn lựa, lai tạo các chủng nấm men có các tính trạng kinh tế tốt ñể dùng vào sản xuất thực phẩm, ñồ uống có cồn cũng như thức ăn chăn nuôi (Myers và Attfield, 1999; Meric và cs., 1995; Trần Văn Hiếu và cs., 2006; ðậu Ngọc Hào và Phạm Minh Hằng, 2000; ðậu Ngọc Hào, 2000; Lê Thành Tâm, 1996; Lê Thành Tâm và cs., [...]... Saccharomyces cerevisiae, có th tìm ra ch th phân t cho các tính tr ng kinh t c a các ch ng vi sinh này, giúp cho vi c giám ñ nh và ñánh giá men gi ng, th c ph m nhanh và hi u qu hơn 1.2 M c ñích và yêu c u 1.2.1.M c ñích - Thi t l p m t b sưu t p các ch ng n m men S cerevisiae - Nghiên c u s ña hình c a các locus SSR c a n m men S cerevisiae ñ s d ng chúng như nh ng ch d u di truy n phân t - Kh o sát các tính. .. Th ng kê toàn b các locus SSR c a n m men d a vào trình t c a ch ng ñã ñư c gi i mã - Thi t k m i cho các locus SSR ti m năng và kh o sát m c ñ ña hình c a các locus ñó, l p b n ñ SSR c a Saccharomyces cerevisiae - Kh o sát các tính tr ng kinh t và tính tr ng sinh h c c a các isolate n m men ð c ñi m, hình thái c a các isolate n m men S sinh trư ng, phát tri n và năng su t sinh kh i Kh năng ch u c... (Skelly và Clark-Walker, 1991) M t vài SSRs ñư c s d ng thành công trong mô t ñ c ñi m và phân bi t gi a các ch ng n m men S cerevisiae (Couto và cs., 1996; Field và Wills năm 1998; Gallego và cs., 1998; Hennequin và cs., 2001) Năm 2001, Perez ñã phát hi n và s d ng các trình t l p l i ñơn gi n trong h gen c a S cerevisiae như makers phân t ñ phân bi t m t s ch ng S cerevisiae (Perez và cs., 2001) Nghiên. .. tr ng kinh t và tính tr ng sinh h c c a các ch ng n m men nh m tìm ra m i tương quan (n u có) gi a ki u gen SSR v i t ng tính tr ng có ý nghĩa kinh t - Tuy n ch n và b o t n các ch ng n m men S cerevisiae có kh năng sinh trư ng m nh, có s c ch ng ch u t t ñ ng th i lên men nhanh và hi u qu ñ ng d ng trong công ngh s n xu t ñ u ng, công ngh th c ph m 1.2.2 Yêu c u - Th ng kê toàn b các locus SSR c... Hi u và cs., 2006; Lê ðình Lương và cs., 1988; Lê Thành Tâm và cs., 1989) T i khoa Sinh c a trư ng ð i h c T ng h p, GS TS Lê ðình Lương và c ng s ñã t o ra các ch ng n m men m i b ng các phương pháp lai và dung h p t bào tr n (Lê Thành Tâm và cs., 1993) T i trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i, Lưu Th Phương và cs ñã kh o sát gi i tính và các tính tr ng sinh h c và ch ng ch u c a các ch ng n m men bánh... ng nghiên c u có ý nghĩa, ñ c bi t là làm mô hình m u ñ nghiên c u các sinh v t nhân chu n khác bao g m c con ngư i (Johnson và cs., 1998; Johnson và cs., 2006) Nhi u gen liên quan t i chu kỳ phân chia t bào c a S cerevisiae tương t các gen ngư i (Harvey và cs., 1996) Hi u bi t v nh ng gen này ñã giúp phân l p và mô t ñ c trưng các gen gây b nh ung thư ngư i (Richardson và cs., 1990; Whitfield và cs.,... khi lên men Lên men là giai ño n quan tr ng cu i cùng và ch y u nh t c a quá trình s n xu t rư u c n Trong quá trình này, n m men th c hi n quá trình thu phân ñư ng Quá trình lên men do tác ñ ng c a các t bào n m men như sau: ñư ng và các ch t dinh dư ng c a môi trư ng lên men ñư c h p ph và khuy ch tán vào bên trong t bào men ñ chuy n hoá qua các h p ch t trung gian và cu i cùng t o thành rư u và khí... 1998), v.v B gen c a n m men ñã ñư c gi i trình t hoàn toàn vào năm 1996 (Dujon, 1996) Cho ñ n nay, g n 5000 trong s kho ng 6000 gen c a n m men ñã bi t ph n nào ch c năng Các nhà nghiên c u ñã phát hi n ra các trình t l p l i ñơn gi n (SSRs) c a n m men phân b trên c 16 NST (Richard và Dujon, 1996; Field và Wills, 1998; Gallego và cs., 1998; Richard và cs., 1999; Young và cs., 2000) và cũng có m t... ñ nh các ch ng n m men s d ng trong công nghi p th c ph m, hay th c ăn chăn nuôi, chúng tôi ch n ñ tài: Nghiên c u ki u gen SSR và các tính tr ng kinh t c a t p ñoàn n m men Saccharomyces cerevisiae Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 2 ð tài này có th cung c p thêm cơ s v phân t và phương pháp h u hi u cho vi c phân ñ nh các ch ng/loài n m men Saccharomyces. .. phát tri n c a n m men l (Regine và cs., 1993) Th c ăn nuôi t bào n m men g m các h p ch t nitơ, h p ch t khoáng, các carbohydrate, vitamin và các ch t sinh trư ng (Bùi ð c H i và cs., 2009) Trư c h t, n m men tiêu hoá các amino acid sau ñó ñ n các s n ph m thu phân protein, n m men h u như không tiêu hoá các protein t nhiên Các mu i luôn là ngu n th c ăn r t t t cho n m men N m men tiêu hoá g n như . BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI CHU THỊ QUỲNH DIỆP NGHIÊN CỨU KIỂU GEN SSR VÀ CÁC TÍNH TRẠNG KINH TẾ CỦA TẬP ðOÀN NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE. dung nghiên cứu 27 3.4.1. Thống kê toàn bộ các locus SSR của S. cerevisiae 27 3.4.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các locus SSR nấm men bằng PCR 27 3.4.3. Khảo sát các tính trạng kinh tế của tập. sát các tính trạng kinh tế của tập ñoàn nấm men 29 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Thống kê toàn bộ các locus SSR của S. cerevisiae 34 4.2. Khảo sát mức ñộ ña hình của các