BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN KIM OANH NGHIÊN C ỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI C ẤY BAO PHẤN LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI – 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Kim Oanh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñề tài luận văn cao học này, ngoài sự nổ lực cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tận tình giúp ñỡ trong quá trình thực tập. ðặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Phan Hữu Tôn - Trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài. Qua ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến gia ñình, người thân và toàn thể bạn bè ñã ñộng viên và khích lệ ñể tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013 Học viên Nguyễn Kim Oanh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích của ñề tài 2 1.3 Yêu cầu của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống cây trồng 3 2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa 7 2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7 2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy bao phấn lúa 11 2.3.1 Kiểu gen của cây cho bao phấn 11 2.3.2 Giai ñoạn phát triển của hạt phấn 13 2.3.3 ðiều kiện sinh lý của cây cho bao phấn 14 2.3.4 Nhiệt ñộ và thời gian xử lý ñòng 15 2.3.5 ðiều kiện nuôi cấy 16 2.3.6 Thành phần môi trường nuôi cấy 16 2.3.7 Qúa trình phân hoá callus 20 2.3.8 Hiện tượng bạch tạng 21 2.4 Cây ñơn bội và ñặc ñiểm di truyền của cây ñơn bội 22 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 24 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24 3.2 ðịa ñiểm và thời gian tiến hành 24 3.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 24 3.2.2 Thời gian tiến hành: 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu 26 3.4.2 Cấy bao phấn ñể tạo callus 26 3.4.3 Tái sinh cây từ callus 27 3.4.4 Môi trường nuôi cấy 27 3.5 Bố trí thí nghiệm 27 3.5.1 Thí nghiệm 1 27 3.5.2 Thí nghiệm 2 27 3.5.3 Thí nghiệm 3 28 3.5.4 Thí nghiệm 4 29 3.5.5 Thí nghiệm 5 29 3.5.6 Thí nghiệm 6 30 3.5.7 Thí nghiệm7 30 3.5.8 Thí nghiệm 8 31 3.6 Phương pháp ñánh giá và xử lý số liệu 31 3.6.1 Phương pháp ñánh giá 31 3.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 32 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Giai ñoạn Tạo callus 33 4.1.1 Phản ứng của bao phấn trong quá trình nuôi cấy 33 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4.1.2 Ảnh hưởng của kiểu gen tới sự hình thành callus 35 4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 39 4.1.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của mẫu cấy 43 4.1.5 Ảnh hưởng của môi trường MS và N6 ñến khả năng tạo callus của mẫu cấy 45 4.1.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến khả năng hình thành callus của bao phấn 47 4.2 Giai ñoạn tái sinh chồi 50 4.2.1 Ảnh hưởng chất lượng callus ñến khả năng tái sinh cây 50 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi 54 4.3 Giai ñoạn ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh 57 4.3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của cây tái sinh 57 4.3.2 Ảnh hưởng của môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây 63 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 5.1 Kết luận 70 5.2 ðề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D Acid 2,4 dichlorophenoxy axetic Cs Cộng sự CT Công thức BAP 6- Benzylaminopurine Kinetin 6- Furfurylaminopurine MS Murashige and Skoog, 1962 N6 Chu & Cs, 1976 NAA Naphlene axetic acid NCBP Nuôi cấy bao phấn NXB Nhà xuất bản Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến sự hình thành callus 35 4.2 ðộng thái hình thành callus sau 5 tuần theo dõi 38 4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 40 4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của các dòng nghiên cứu 43 4.5 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn lúa 46 4.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ chết của các dòng nghiên cứu 48 4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N39 54 4.7b Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N13 56 4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở các công thức thí nghiệm 2 dòng N39 và N13 59 4.9 Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến tỷ lệ sống của cây lúa 63 4.10 Ảnh hưởng của một số môi trường thuần dưỡng ñến chiều dài rễ, chiều cao cây, số lá và số nhánh 64 4.11 Khả năng sống của cây in vitro trong ñiều kiện tự nhiên 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Hình ảnh callus 34 4.2 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến khả năng hình thành callus 37 4.3 Mối tương quan giữa tỷ lệ bao phấn chết và tỷ lệ bao phấn tạo callus 37 4.4a Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N39 41 4.4b Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N13 41 4.5a Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N39 44 4.5b Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu cấy dòng N13 44 4.6 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn lúa 2 dòng N39 và N13 (sau 4 tuần theo dõi) 46 4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ chết ở các công thức dòng N39 49 4.7b Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ chết ở các công thức dòng N13 49 4.8 Ảnh callus chấm xanh 52 4.9 Ảnh tái sinh cây xanh 52 4.10 Ảnh rễ cây ăn lan vào môi trường thạch 52 4.11 Ảnh callus tái sinh một cây xanh và một cây bạch tạng 53 4.12 Ảnh rế ức chế chồi phát triển 53 4.13 Ảnh tái sinh cây bạch tạng 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix 4.14a Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N39 55 4.14b Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các công thức nghiên cứu thuộc dòng N13 56 4.15 Chồi xanh tái sinh từ callus sau 25 ngày nuôi cấy 57 4.16 Chồi lúa mới ñược cấy trên môi trường ra rễ 58 4.17a Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở các công thức nghiên cứu dòng N39 60 4.17b Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở các công thức nghiên cứu dòng N13 60 4.18 Cây lúa N39 sau 10 ngày cấy trên môi trường ra rễ 61 4.19 Ảnh ra rễ trong môi trường thạch của cây tái sinh 61 4.20a Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây lúa dòng N39 65 4.20b Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây lúa dòng N13 65 4.21 Ảnh cây in vitro ñạt tiêu chuẩn ra cây 69 4.22 Ra cây ngoài tự nhiên 69 [...]... t qu nuôi c y bao ph n lúa và ng d ng chúng trong ch n t o dòng thu n chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài: Nghiên c u hoàn thi n quy trình nuôi c y bao ph n lúa 1.2 M c ñích c a ñ tài Xác ñ nh ñư c ñi u ki n nuôi c y t i ưu nh t cho quá trình t o callus và tái sinh cây xanh Hoàn thi n quy trình k thu t nuôi c y bao ph n lúa 1.3 Yêu c u c a ñ tài Nghiên c u 3 giai ño n: Giai ño n t o callus: Nghiên. .. VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 V t li u và ph m vi nghiên c u 3.1.1 V t li u nghiên c u - V t li u ngiên c u là các dòng lúa thu c hai loài ph : Indica và Japonica Loài ph Dòng PL7-1 PL7-2 PL8 Indica PL10-2 PL12-2 PL16 N1 N9 Japonica N13 N39 3.1.2 Ph m vi nghiên c u Tên ñ tài: Nghiên c u hoàn thi n quy trình nuôi c y bao ph n lúa Xác ñ nh ñư c ñi u ki n nuôi c y t i ưu nh t cho quá trình t o callus... Trên th gi i cũng như t i Vi t Nam, k thu t nuôi c y bao ph n ñã thành công nhi u ñ i tư ng cây tr ng trong ñó có cây lúa. Tuy nhiên, hi u qu c a quá trình nuôi c y bao ph n lúa ph thu c nhi u y u t : ki u gen c a cây ñưa vào nuôi c y, y u t môi trư ng: nhi t ñ , ánh sáng, thành ph n các ch t trong môi trư ng nuôi c y và các k thu t x lý trư c và sau khi nuôi c y bao ph n (Tr n Duy Quý, 1999; Asoliman,... Anh và cs, 2004) [2] 2.3 Các y u t nh hư ng ñ n quá trình nuôi c y bao ph n lúa Thành công c a nuôi c y bao ph n ch u nh hư ng c a r t nhi u y u t M ts y ut nh hư ng ñ n NCBP ñã ñư c nghiên c u như: Ki u gen c a m u c y, t c ñ tăng trư ng, ñi u ki n c a cây cho bao ph n, phương pháp nuôi c y, các ch t ñi u hòa sinh trư ng ñư c ñưa vào môi trư ng nuôi c y…(Chi- Chang- Cheng & Hsin- Sheng – Tsay, 1991;... Phương pháp nghiên c u Quá trình nuôi c y bao ph n ñư c th c hi n theo quy trình sau: X lý l nh 7ngày Ch n ñòng Ki u gen Nhà kính Ra r Cây nh b i Cây ñơn b i T o ch i xanh Colchicine Tách bao ph n Tái sinh ch i T o mô s o Cây nh b i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 25 3.4.1 L y m u và x lý m u - Th i gian l y ñòng lúa t 8-9 gi sáng Ch n và l y ñòng lúa s... Dương ñã nghiên c u và thu ñư c nhi u dòng t t t phương pháp này khi k t h p lai và nuôi c y bao ph n k t h p gây ñ t bi n và c y bao ph n, ñ ng th i b môn cũng ñã có chương trình ch n t o gi ng lúa m i có năng su t cao, ch ng ch u t t, th i gian sinh trư ng ng n, có ch t lư ng thương ph m, dinh dư ng cao (Nguy n M nh ðôn, Huỳnh Yên Nghĩa, 2000) [5] K t h p v i ch th phân t v i nuôi c y mô bao ph n,... ñã có hàng lo t nh ng nghiên c u v v n ñ này, t p trung vào hai hư ng chính là c i t o v m t di truy n ph n ng trong nuôi c y bao ph n thông qua ch n l c, lai t o (Herath, 2007) [31] và t i ưu hóa môi trư ng nuôi c y (Bidhan, 2005; Chen, 2007) [24] [27] Có nhi u nghiên c u v nuôi c y bao Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 1 ph n lúa ñã ñư c công b nhưng... là thích h p v i nuôi c y bao ph n lúa và nhi u cây tr ng khác (Nguy n ð c Thành, 2001) [15] Khi tăng nhi t ñ thì t l callus tăng và t l cây b ch t ng cũng tăng Theo Wang và Sun (1978) khi tăng nhi t ñ nuôi c y lên 300C trong su t quá trình nuôi c y thì t l t o callus tăng lên nhi u nhưng các cây tái sinh ra h u h t là cây b ch t ng [43] 2.3.6 Thành ph n môi trư ng nuôi c y Các k t qu nghiên c u ñ u... c a ch t ñi u hòa sinh trư ng, m u nuôi c y Nuôi c y bao ph n lúa trên môi trư ng nh t thi t ph i tr i qua 2 bư c v i s có m t c a auxin và cytokinie ñư c b sung vào môi trư ng, m c dù các bao ph n r t giàu các ch t ñi u ti t sinh trư ng th c v t S lư ng, ch t lư ng và s cân b ng gi a auxin và cytokinin là cơ s chính quy t ñ nh ph n ng c a bao ph n v i môi trư ng nuôi c y Hi u qu tác ñ ng c a ch t... ng lúa Nuôi c y bao ph n là phương pháp h u hi u t o dòng ñ ng h p t tuy t ñ i, hoàn toàn không phân ly trong các th h sau Bên c nh ñó, thông qua k thu t nuôi c y bao ph n có th c ñ nh ñư c ưu th lai và các gen h u tính t con lai F1, có ưu th lai cao, làm tăng năng su t lúa (M.S.Swaminathan, 1995; Chen et al, 1978; Narayanan et al,1996; Siddiq et al, 1994; Zhu De Yao, 1998) [36] M t khác, trong quá trình . hưởng tới kết quả nuôi cấy bao phấn lúa và ứng dụng chúng trong chọn tạo dòng thuần chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn lúa . 1.2. Mục ñích. pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống cây trồng 3 2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa 7 2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7 2.2.2 Tình hình nghiên cứu. ñịnh ñược ñiều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho quá trình tạo callus và tái sinh cây xanh. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa. 1.3. Yêu cầu của ñề tài Nghiên cứu 3 giai ñoạn: