BỘ GIÁO DỤC ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  BÙI THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM NÔNG SINH H ỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG VIRUS PVY CỦA CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  BÙI THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM NÔNG SINH H ỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG VIRUS PVY CỦA CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS. TS. NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2013 Tác giả Bùi Thị Phương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CẢM ƠN! ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi của Thầy Cô, Gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo NGND.GS.TS Nguyễn Quang Thạch, người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Thủy, kỹ sư. ðỗ Thị Thu Hà ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi về thời gian, cơ sở vật chất thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này. Hà Nội ngày 20 tháng 08 năm 2013 Tác giả Bùi Thị Phương iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ðẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 3 1.1.1 Nguồn gốc 3 1.1.2 Phân loại 3 1.1.3 Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây 4 1.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 6 1.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 6 1.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam 8 1.3 Tình hình bệnh virus hại khoai tây 9 1.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây 9 1.3.2 Tác hại của bệnh virus 11 1.4 Giải pháp khắc phục 13 1.4.1 Các giải pháp về canh tác 13 1.4.2 Giải pháp công nghệ sinh học 13 1.5 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần 17 1.5.1 Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới 17 2.5.2 Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ñối tượng cây khoai tây ở Việt Nam. 22 v Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu. 25 2.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phòng 25 2.3.2 Các phương pháp thí nghiệm ñồng ruộng 27 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 ðánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng thông qua kiểm tra gen kháng bằng phương pháp PCR. 30 3.2 ðánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng thông qua lây nhiễm nhân tạo. 32 3.3 Nghiên cứu ñánh giá sự khác nhau về sự sinh trưởng, phát triển, hình thành năng suất và phẩm chất củ của các con lai soma khoai tây so với ”bố mẹ” của chúng trong ñiều kiện chậu vại. 38 3.3.1 Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các con lai soma và ”bố mẹ” của chúng trong ñiều kiện chậu vại. 38 3.3.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai soma khoai tây và các dòng “bố mẹ” của chúng. 42 3.3.3 Các chỉ tiêu hình thái củ và chất lượng chế biến của củ 46 3.3.4 Phân loại cấp củ sau khi thu hoạch 50 3.4 ðánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng con lai soma khoai tây và ”bố mẹ” của chúng. 52 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56 1 Kết luận 56 5.2 ðề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 61 vi DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên ñầy ñủ 1 bp Base pair 2 cs Cộng sự 3 DAS-ELISA Double Antibody Sanwich- Enzyme linked 4 DNA DeoxyribonucleicAcid 5 M Ladder 6 MS Murashige Skoog 7 NSLT Năng suất lý thuyết 8 NSTT Năng suất thực thu 9 SSR Simple sequence repeat 10 PA Polyacrylamid 11 PCR Polymerase Chain reaction 12 PVY Potato virus Y 13 PVYC Potato virus Y strain C 14 PVYN Potato virus Y strain N 15 PVYNTN Potato virus Y strain (variant) NTN 16 PVYO Potato virus Y strain O 17 PVX Potato virus X vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên hình Trang 1.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế giới năm 2011 (FAOSTAT) 6 1.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 (triệu tấn) (FAOSTAT) 7 1.3 Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987; Burton 1989; Brunt và cs 1996) 10 2.1 Thông tin cơ bản về các dòng ”bố mẹ” 23 2.2 Các dòng con lai soma tái sinh ñược từ 4 tổ hợp dung hợp nghiên cứu 23 2.3 Các mồi sử dụng ñể chạy PCR phát hiện gen kháng virus PVY của các con lai soma khoai tây và ”bố mẹ” của chúng. 24 3.1 Kết quả khi lây nhiễm nhân tạo virus PVY sau 15 ngày của các con lai soma và “bố mẹ” của chúng. 36 3.2 Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các con lai soma và “bố mẹ” của chúng 39 3.3 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng con lai soma và “bố mẹ” của chúng 43 3.4 Một số kết quả ñánh giá ñặc ñiểm thực vật học củ các con lai soma khoai tây và ”bố mẹ” của chúng. 47 3.5 Phân loại cấp củ sau khi thu hoạch 51 3.6 Một số chỉ tiêu hóa sinh của các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng 53 viii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ ñồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai tạo, nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp tế bào trần (Wenzzel và cộng sự 1976). 18 3.1 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GP 122 406 c liên kết chặt với gen Ry sto – gen kháng virus PVY 30 3.2 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GP122 718 b liên kết chặt với gen Ry sto - gen kháng virus PVY 31 3.3 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virut PVY của các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên bản Elisa1 33 3.4 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virus PVY của các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên bản Elisa2 34 3.5 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virus PVY của các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên bản Elisa3 35 3.6 Thí nghiệm ñánh giá ñặc tính sinh trưởng phát triển của các con lai soma và “bố mẹ” của chúng 40 3.7 Hình ảnh con lai và “bố mẹ” của một số tổ hợp lai 41 3.8 Hình ảnh củ ñại diện của các dòng “bố mẹ” và con lai của chúng 46 3.9 Hình ảnh về số lượng củ trung bình /khóm của một số con lai soma khoai tây 48 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 MỞ ðẦU 1 ðặt vấn ñề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan trọng của con người, xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và ñại mạch (FAO, 2005). Với ñặc ñiểm dễ canh tác và có hàm lượng dinh dưỡng cao, khoai tây là một cây trồng quan trọng trong việc ñảm bảo an ninh lương thực cho con người. Tuy nhiên hiện nay, sự thoái hóa giống khoai tây ñang là vấn ñề nghiêm trọng, ñặc biệt là sự thoái hóa do bị nhiễm bệnh virus. ðiển hình là nhiễm virus PLRV và virus PVY ở khắp các vùng trồng khoai tây trên thế giới, làm giảm năng suất và chất lượng củ, ước tính thiệt hại lên tới khoảng 20 triệu tấn mỗi năm (Koijima và Lapierre, 1988]. ðể giải quyết vấn ñề này ñã có nhiều giải pháp ñược ñề xuất, trong ñó chọn tạo giống khoai tây kháng virus ñã và ñang thu ñược kết quả tốt. Tuy nhiên bộ NST của khoai tây là tứ bội (2n=4x=48) nên gây khó khăn cho công tác chọn tạo giống theo con ñường cổ ñiển như lai tạo, ñột biến, chọn lọc (Kuckuck và cs, 1985)[30], các kỹ thuật này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền. Trên cơ sở bộ genom tứ bội (2n=4x=48) tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, khiến quá trình chọn lọc sau ñấy rất khó khăn với một quần thể rất lớn. Quá trình chọn tạo giống mới tốn rất nhiều công sức và thời gian. Dung hợp protoplast là con ñường có hiệu quả ñể khắc phục ñược khó khăn trong quá trình lai tạo hữu tính khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra sự tái tổ hợp gen ở những loài ña bội hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính kém phát triển. Gần ñây, phòng Công nghệ Sinh học Khoai tây - Viện Sinh học Nông nghiệp ñang nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần, bước ñầu thành công trong nghiên cứu quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy, tái sinh protoplast tạo ra các con lai soma khoai tây phục vụ cho chương [...]... ng khoai tây kháng virus Hàng lo t con lai soma ñư c t o ra c n ñư c ñánh giá ð ti p n i chương trình ch n t o gi ng khoai tây theo hư ng này, chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u ñánh giá ñ c ñi m nông sinh h c và kh năng kháng virus PVY c a các con lai soma khoai tây 2 M c ñích và yêu c u 2.1 M c ñích Xác ñ nh ñư c các con lai soma khoai tây mang nh ng ñ c ñi m nông sinh h c t t và có kh năng kháng. .. virus PVY ph c v cho chương trình ch n t o gi ng khoai tây 2.2 Yêu c u - ðánh giá ñư c kh năng sinh trư ng, phát tri n hình thành năng su t c a các con lai soma trong ñi u ki n ch u v i - ðánh giá ñư c ch t lư ng ch bi n và ăn tươi c a các con lai soma - ðánh giá ñư c kh năng kháng virus PVY c a các con lai soma thông qua vi c ki m tra gen kháng b ng phương pháp PCR - ðánh giá kh năng kháng virus PVY. .. virus PVY c a các con lai soma khoai tây và “b m ” b ng phương pháp lây nhi m nhân t o N i dung 3: Nghiên c u ñánh giá s sinh trư ng, phát tri n, năng su t và ph m ch t c c a các con lai soma khoai tây và cây ”b m ” (tr ng trong ch u v i) N i dung 4: ðánh giá m t s ch tiêu hóa sinh c a c các con lai soma khoai tây và ”b m ” c a chúng sau khi thu ho ch 2.3 Phương pháp nghiên c u 2.3.1 Các phương pháp nghiên. .. A56, A41, B186, B208 (Vi n nghiên c u Tài nguyên cây tr ng – Bavaria – Công hòa liên bang ð c cung c p) B ng 2.1 Thông tin cơ b n v các dòng ”b m ” Các dòng b m A15 - Có gen kháng virus PVY A16 - Có gen kháng virus PVY A41 - Có gen kháng virus PVY B186 - Có gen kháng virus PVY A56 - Có gen kháng virus PVY B208 - Có gen kháng virus PVY - 17 dòng con lai soma khoai tây t b i tái sinh ñư c sau dung h p b... Theo nghiên c u c a Nguy n Thơ, Nguy n Phương ð i, Hà Minh Trung, Vũ Tri u Mân (1978 – 1986) v virus khoai tây Mi n B c Vi t Nam cho th y: B nh virus khoai tây Vi t Nam do 7 loài virus gây h i chính ðó là: Virus Y khoai tây (PVY) Virus X khoai tây (PVX) VirusA khoai tây (PVA) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 9 Virus S khoai tây (PVS) Virus M khoai tây. .. ngh sinh h c khoai tây thu c Vi n Sinh h c Nông nghi p – Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 24 • Th i gian nghiên c u ð tài ti n hành t tháng 8/2012 – 8/2013 2.2 N i dung nghiên c u N i dung 1: Ki m tra gen kháng virus PVY c a các con lai soma khoai tây và “b m ” b ng phương pháp PCR N i dung 2: ðánh giá kh năng kháng virus. .. m t s nhóm virus và kháng vector truy n b nh (Austin và cs, 1985b; Fish và cs, 1987; Vankonen và cs, 1994b) Tùy thu c vào thành ph n gen c a con lai soma mà bi u hi n m t s các bi n ñ i v tính tr ng hình thái và ph n ng l i s xâm nhi m virus PVX b i vector (Thieme và cs, 2000) M t s con lai soma ñư c lai l i thành công v i dòng khoai tây tr ng mà v n bi u hi n tính kháng Hàng lo t con lai soma c a S... ……………………… 19 1987; Deimling và cs,1988; Chaput và cs, 1990; Wenzel, 1979; Thach et al., 1993) Các công trình nghiên c u t o các con lai soma t h p ñư c các ñ c tính kháng b nh virus t b m ñã ch n l c (2x) cũng ñư c r t nhi u tác gi nghiên c u thành công Các tác gi này th a nh n có th t h p ñư c các ñ c tính kháng b nh (virus PVY, PVX, m c sương, r p) c a b m vào con lai soma và các ñ c tính này có th quan... etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 th hi n kháng t t v i PVY và tính r t kháng v i PVX (Gavrirenco và cs, 2003) Nghiên c u c a Polgar và cs (2002) ñã t o ñư c 150 dòng lai soma gi a khoai tây Hungari và S brevidens cùng m t vài th h BC K t qu cho th y t t c con lai và h u h t dòng BC Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 16 bi u hi n m c kháng cao v i virus PVY. .. dõi và ñánh giá các ñ c ñi m nông sinh h c (Ph l c 5) - Các d ng c và máy móc c n thi t cho các thí nghi m: C i s , pipet, cân vi lư ng, máy ñi n di, máy PCR, máy ly tâm, máy xung ñi n - ð ñánh giá tính kháng virus PVY c a các con lai soma và các dòng ”b m ” chúng tôi s d ng hai c p m i ñ c hi u theo Czech J Gennet (2007) C p m i GP 122406c liên k t ch t v i gen Rysto là m t gen kháng có kh năng kháng . ñiểm nông sinh học và khả năng kháng virus PVY của các con lai soma khoai tây . 2. Mục ñích và yêu cầu 2.1. Mục ñích Xác ñịnh ñược các con lai soma khoai tây mang những ñặc ñiểm nông sinh học. virus PVY của các con lai soma khoai tây và “bố mẹ” của chúng sau khi lây nhiễm 15 ngày trên bản Elisa2 34 3.5 Ảnh Elisa kiểm tra ñộ tinh sạch virus PVY của các con lai soma khoai tây và. soma và “bố mẹ” của chúng. 36 3.2 Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các con lai soma và “bố mẹ” của chúng 39 3.3 Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng con lai