ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long Mục lục Lời mở đầu Công nghệ sinh học là nền tảng của nên kinh tế tri thức, thu hút nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ tế bào, công nghệ enzyme và protein, công nghệ vi sinh vật, công nghệ lên men, công nghệ môi trường, … Ngành công nghệ enzyme được phát triển mạnh từ những năm 1960, nhờ ứng dụng công nghệ lên men vi sinh vật và gần đây hơn là nhờ thành tựu của công nghệ di truyền. Ngày nay, việc khai thác và sử dụng enzyme không còn là quá trình thủ công, mang tính chất truyền thống mà đã phát triển thành một ngành công nghiệp với những kỹ thuật hoàn chỉnh và đem lại lợi nhuận không nhỏ. Năm 1980, chế phẩm amylase được sản xuất được sản xuất đến 320 tấn. Năm 1984- 1990, người ta đã tiêu tốn 15-20 triệu USD cho nhu cầu sử dụng enzyme này. (2) Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Đó là lợi thế giúp cho ngành công nghiệp sản xuất enzyme phát triển mạnh mẽ. Chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc có vai trò đặc biệt quan trọng đối với rượu cồn, thực phẩm lên men, công nghiệp dệt, sản xuất thức ăn gia súc và cả trong y học. SVTH: Trang 1 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long Chính vì vậy tôi chọn đề tài: Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme amylase từ vi sinh vật Asp.nigerbằng phương pháp lên men bề mặt, công suất 5000 tấn/năm vớiđộ đậm đặc tăng gấp 10 lần so với sản phẩm lên men thô. SVTH: Trang 2 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về enzyme amylase 1.1.1. Enzyme amylase: Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong giới sinh vật, xúc tác thủy phân tinh bột thành đường. Enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực khác đặc biệt là công nghệ thực phẩm. Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột có thể chia amylase thành các loại sau: 1.1.1.1. α-amylase (1) α-amylase là một enzyme có phân tử lượng thấp, nằm trong khoảng từ 50.000 đến 60.000 Dal.  Cấu trúc không gian của α-amylase α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. α-amylase không chỉ thủy SVTH: Trang 3 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột nguyên, song với tốc độ rất chậm. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose hoặc dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Một số tính chất của enzyme amylase: ♦ pH tối thích cho enzyme α-amylase từ nấm sợi là 4.0-4.8. Đặc biệt enzyme α- amylase từ Asp.nigercó thể chịu được pH=2.5-2.8. ♦ Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50ºC và bị vô hoạt ở 70ºC (Kozmina, 1991). ♦ α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6- glucosidase của amylopectin nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. 1.1.1.2. β- amylase:  Cấu trúc phân tử β-amylase β- amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. β- amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α- 1,4- glucan trong tinh bột, glucogen SVTH: Trang 4 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose có cấu hình β vì thế enzyme này được gọi là enzyme β- amylase. Tác dụng của β- amylase lên hồ tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau: Tinh bột >maltose (54-58%) + β- dextrin (42-46%) β- amylase là một abumin, trung tâm xác tác chứa nhóm –SH, nhóm X- COOH và vòng imidazol của các gốc histindine. β- amylase không bền khi có Ca2+. β- amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+ , urea, iodine, ozon,… β- amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid. Nhiệt độ tối thích của β- amylase là 55ºC, nó bị bất hoạt ở 70ºC. pH tối thích 5.1-5.5. 1.1.1.3. γ- amylase (glucoamylase):  Cấu trúc phân tử glucoamylase γ- amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc Aspergillus, Penicillum, Rhizopus. γ- amylase từ phân tử nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000Dal. SVTH: Trang 5 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long γ- amylase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thủy phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thủy phân được các liên kết α-1,5 và α-1,3 nhưng rất chậm. γ- amylase có thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các enzyme khác. γ- amylase thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các phân tử nhỏ. Đa số các γ-amylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3.5-5.5 và nhiệt độ 50ºC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone. 1.1.1.4. Oligo-1,6- glucosidase:  Cấu trúc oligo-1,6-glucosidase Enzyme này có thể thủy phân liên kết α-1,6- glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Oligo 1,6-glucosidase có nhiều trong các vi sinh vật đồng thời cũng có nhiều trong các hạt nảy mầm. Nhiệt độ tối thích cho enzyme này là 40ºC và pH tối thích là 5.1. SVTH: Trang 6 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long 1.1.1.5. α - dextrin-6-glucosidase (pullulanase): Enzyme này có thể thủy phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hóa các cơ chất này đên đường lên men được. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân những dextrin phân tử thấp chỉ gồm 2 gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng đồng thời của α-amylase và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn.  Cấu trúc pullulanase 1.1.1.6. α – glucosidase hay maltase: Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là một enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α- 1,4 trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu. SVTH: Trang 7 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long 1.1.2. Ứng dụng (2) 1.1.2.1. Trong công nghiệp sản xuất rượu bia: Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng amylase từ malt để thủy phân tinh bột ở giai đoạn đường hóa. Như vậy cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở quy mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và giá thành sản phẩm. Để khắc phục điều này, các nhà sản xuất sử dụng chế phẩm enzyme amylase thay thế một phần malt. Nhờ vậy, giá thành của sản phẩm được giảm trong khi đó sản phẩm vẫn giữ được đặc trưng của bia. Trong công nghiệp sản xuất rượu từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng một nguồn nguyên liệu khác nhau. Ở Mỹ, người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mỳ, ở nước ta và một số nước khác sử thì sử dụng gạo. Trong giai đoạn đường hóa người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase. Người Nhật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trính đường hóa để sản xuất rượu sake cách đây hơn 1700 năm. Ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzyme này thay cho amylase của malt trong sản xuất bia. Nhờ sự du nhập này mà người Mỹ đã tiết kiệm được chi phí khổng lồ cho công nghiệp sản xuất rượu, bia. 1.1.2.2. Trong sản xuất bánh mỳ Đây là ngành tiêu thụ một lượng lớn tinh bột và enzyme thủy phân tinh bột. Amylase được thêm vào trong hỗn hợp bột để phân giải tinh bột thành các dextrin ngắn hơn và những dextrin này sẽ được lên men. Sự thêm malt và amylase vào hỗn hợp bột làm tăng thể tích và cải thiện kết cấu sản phẩm nướng. Từ lúc bắt đầu, amylase được thêm vào trong suốt quá trình chuẩn bị bột nhão để sinh ra những hỗn hợp lên men. Bên cạnh việc sinh ra hỗn hợp lên men, amylase cũng có tác dụng chống ôi trong việc nướng bánh mỳ và duy trì độ mềm mịn cho sản phẩm nướng (Olesen, 1991). SVTH: Trang 8 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long 1.1.2.3. Trong chế biến thức ăn gia súc Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tang hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột người ta thường cho them enzyme amylase vào. Enzyme này sẽ tham gia vào quá trình phân giải tinh bột thành đường, giúp quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. 1.1.2.4. Trong công nghiệp dệt Ngươi ta sử dụng enzyme amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho mềm vải. Trong vải thô thường chứa khoảng 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó, để làm mềm vải và tang khả năng nhúng nước, người ta dung enzyme từ vi khuẩn hay nấm mốc. Phương pháp dung enzyme không làm tổn hại vải, độ mao dẫn tốt, đảm bảo vệ sinh. 1.1.2.5. Trong y học Amylase cùng các enzyme khác được dùng trong y học để làm thuốc chữa một số bệnh do thiếu enzyme, kém khả năng chuyển hóa vật chất, bệnh về tiêu hóa, thần kinh,… Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP để điều chế thuốc trị bệnh tim mạch, thần kinh,… 1.2. Tổng quan về nấm mốc Asp.niger và phương pháp lên men bề mặt 1.2.1. Asp.niger [3] Giống Aspergilluscó khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, acid hữu cơ,… VanTieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Asp.niger từ hạt chứa nhiều dầu như hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cốc, ngô,… Asp.niger cũngđược phân lập từ các sản phẩm lên men cổ truyền. (Lương Đức Phẩm, 2004) SVTH: Trang 9 ĐACN 2 GVHD: TS. Đặng Đức Long 1.2.1.1. Lịch sử phát hiện Giống Aspergillus do Michelli lần đầu tiên được mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này. Raper và Fennell (1965) chỉ dung một số tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần. Như vậy, Asp.niger có vị trí phân loại như sau: Lớp: Deuteromyces Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceace Giống: Aspergillus 1.2.1.2. Đặc điểm hình thái: Dưới kính hiển vi nấm Asp.nigercó khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọng hình cầu 5-6 x 20-30mm, đôi khi 6-10 x 60-70mm. Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, có gai nhọn, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4-5mm.  Asp.niger trên đĩa thạch SVTH: Trang 10 [...]... Bào tử Asp.niger Đặc điểm sinh học: Asp.nigerlà vinh sinh vật hiếu khí bắt buộc, dị dưỡng hóa năng, sinh sản bằng bào tử, sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8ºC, tối đa 45-47ºC, tối ưu 25-28 ºC, độ ẩm tối thiểu 23% Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 6065% Asp.nigersinh trưởng và phát triển khi có mặt O2, pH tối ưu 4-6,5 Tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng Asp.nigersinh... trọng đến hoạt động sống của vi sinh vật và khả năng sinh tổng hợp enzyme Đứng trên quan điểm điều khiển khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm có chủ đích thì thành phần môi trường dinh dưỡng phải đáp ứng được yêu cầu chính là phải có độ hoàn thiện đảm bảo Trong môi trường dinh dưỡng phải có đủ các chất đảm bảo sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme Vi sinh vật cần phải được... 335 Số liệu ban đầu Năng suất: 5000 tấn/năm Năng suất sản phẩm enzyme thô của nhà máy tính theo ngày là: (kg/ngày) Tỷ trọng enzyme: 1,15 (kg/lit) Nồng độ enzyme sau lên men: 30g/1kg cơ chất Thành phần môi trường: SVTH: Trang 21 ĐACN 2 GVHD: TS Đặng Đức Long Cám gạo 56% Trấu 23% Bã đậu nành 20.7% MgSO4 0.05% KH2PO4 0.1% NH4NO3 0.15% Bảng 3.2: Bảng tỷ lệ hao hụt qua các công đoạn Công đoạn Xử lý (cám gạo;... và sự tạo thành amylase Thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn Nitơ Nguồn Nitơ hữu cơ thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là peptone loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đó 1.3.3 Nguồn thức ăn khoáng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme, thiếu Mg... 150g/lit Tiến hành: Dịch sau trích ly được đi vào thiết bị cô đặc chân không Nhiệt độ cô đặc: 50-55°C 2.3.12 Đóng gói Sau khi thu được chế phẩm enzyme ta đem đi đóng gói bằng thiết bị bao gói tự động khối lượng của mỗi gói tùy thuộc vào nhu cầu khách hàng SVTH: Trang 20 ĐACN 2 GVHD: TS Đặng Đức Long Chương 3 TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT 3.1 Kế hoạch sản xuất của phân xưởng Các ngày nghỉ trong năm: - Tết... thái hoạt động bằng cách cấy truyền mỗi tháng một lần trong các môi trường thạch sapec Thành phần môi trường thạch sapec: Nước 100 0ml Saccroza 30g NaNO3 3g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0.5g KCL 0.5g FeSO4 0.01g 10 ml dịch tự phân nấm men pH = 4 ÷ 5 Nhân giống trên máy lắc Cũng môi trường trên mốc giống được nuôi trong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc,... Nồng độ trước cô đặc: 7g/l Nồng độ sau cô đặc: 150g/l Khối lượng trước khi cô đặc: (kg/ngày) Thể tích lúc này: (lit/ngày) Lượng enzyme có trong sản phẩm: (kg/ngày) Lượng sản phẩm hao hụt: (kg/ngày) 3.2.3 Lọc Tỷ lệ hao hụt: 2% Khối lượng trước khi lọc: (kg/ngày) Thể tích trước khi lọc: SVTH: Trang 23 ĐACN 2 GVHD: TS Đặng Đức Long (lit/ngày) Lượng enzyme có trong sản phẩm trước khi lọc: (kg/ngày) Lượng sản. .. Nghiền Thu dịch enzyme (trích ly) Lọc Cô đặc chân không Bao gói Tỉ lệ hao hụt (%) 0,5; 0,5; 0,5 1 0,5 0,1 2 3 2 2 0,1 3.2 Cân bằng vật chất 3.2.1 Bao gói Tỷ lệ hao hụt: 0.1% Lượng sản phẩm trước khi bao gói: (kg/ngày) Thể tích trước khi bao gói: (lit/ngày) Lượng enzyme có trong sản phẩm: (kg/ngày) SVTH: Trang 22 ĐACN 2 GVHD: TS Đặng Đức Long Lượng sản phẩm hao hụt: (kg/ngày) 3.2.2 Cô đặc chân không... của thiết bị là: H2= H + h +l = 3,3+2,16+0,5= 5,96 (m) 4.8 Máy nghiền bã đậu nành (9) Chọn máy nghiền trục đứng TĐ600x600 Khối lượng bã đậu nành cần nghiền 8647,2 (kg/ngày) Thông số kỹ thuật: Cỡ hạt nguyên liệu (mm) ≤ 40 Cỡ hạt sản phẩm (mm) ≤3 Năng suất (tấn /h) 3 Công suất (kW) 22 Kích thước (mm) 600600 Số thiết bị cần dùng Chọn 1 máy nghiền bã đậu nành 4.9 Vít tải vận chuyển bã đậu nành đến máy. .. giống Thanh trùng (140oC) Nhân giống sản xuất Làm nguội Lên men Khay Thanh trùng khay Nghiền mịn Nước Trích ly Lọc Cô đặc chân không Bao gói Chế phẩm enzyme thô SVTH: Trang 15 Bã ĐACN 2 GVHD: TS Đặng Đức Long 2.2 Thuyết minh dây chuyền công nghệ 2.3.1 Nguyên liệu 2.3.1.1 Nguyên liệu cám gạo Cám gạo được gàu tải vận chuyển lên bunke chứa, sau đó được vít tải vận chuyển từ bunke đến sàng phân loại Cám gạo . sản xuất enzyme amylase từ vi sinh vật Asp. nigerbằng phương pháp lên men bề mặt, công suất 5000 tấn/năm với ộ đậm đặc tăng gấp 10 lần so với sản phẩm lên men thô. SVTH: Trang 2 ĐACN 2 GVHD: TS triển của vi sinh vật. Đó là lợi thế giúp cho ngành công nghiệp sản xuất enzyme phát triển mạnh mẽ. Chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc có vai trò đặc biệt quan trọng đối với rượu cồn, thực phẩm lên men, . protein, công nghệ vi sinh vật, công nghệ lên men, công nghệ môi trường, … Ngành công nghệ enzyme được phát triển mạnh từ những năm 1960, nhờ ứng dụng công nghệ lên men vi sinh vật và gần đây hơn