Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ LÊ LỢI TÍNH TOÁN TẦN SUẤT HAPLOTYPE HỆ 17 Y-STR PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH TẠI VIỆN KHOA HỌC HÌNH SỰ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Hà Nội, tháng 11-2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ LÊ LỢI TÍNH TOÁN TẦN SUẤT HAPLOTYPE HỆ 17 Y-STR PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH TẠI VIỆN KHOA HỌC HÌNH SỰ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Hà Hà Nội, tháng 11-2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Thượng tá Nguyễn Văn Hà, Phó giám đốc Trung tâm giám định Sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an. là người đã quan tâm hướng dẫn tận tình và luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm luận án. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo, tập thể cán bộ Trung tâm giám định sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Vũ Lê Lợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Sơ lược về người Việt (Kinh) 3 1.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể Y 4 1.3 Các chỉ thị di truyền trong phân tích nhiễm sắc thể Y 5 1.4 Các kít thương mại phân tích nhiễm sắc thể Y 8 1.5 Dữ liệu YSTR Haplotype 9 1.6 Ý nghĩa thống kê của phân tích nhiễm sắc thể Y trong hình sự 11 1.7 Ứng dụng của phân tích ADN trên nhiễm sắc thể Y 12 1.8 vấn đề sử dụng Y-STR trong phân tích AND phục vụ giám định pháp lý 14 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất 17 2.1.3 Thiết bị máy móc và dụng cụ 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phân tích AND 17 2.2.2 Phân tích dữ liệu AND 22 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1. Kết quả tách chiết ADN bằng phương pháp vô cơ sử dụng chelex 100 24 3.2. Kết quả PCR25 3.3. Phân tích alen và tính toán tần suất Y-STR haplotype 25 3.4. Kết quả sử dụng công cụ trực tuyến YHRD để tính khoảng cách di truyền giữa quần thể nghiên cứu và các quần thể có sẵn trong cơ sở dữ liệu 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN 33 KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - STR Short Tandem Repeat - Y‐STR Y‐ chromosome Short Tandem Repeat - DNA Deoxyribonucleic Acid - PCR Polymerase Chain Reaction - AMPS Ammonium Persulfate - dNTPs Deoxy Nucleotide Tri Phosphates - EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Di‐Sodium Salt - FDL Forensic DNA Laboratory - DC Discrimination Capacity - HD Haplotype Diversity - GD Gene Diversity - bp base pairs - PCR Polymerase Chain Reaction - YHRD Y‐Chromosome Haplotype Reference Database - SWGDAM Scientific Working Group on DNA Analysis Methods - NRY Non‐recombining Y‐chromosome - SNP Single Nucleotide Polymorphism - mtDNA Mitochondrial DNA - PAR Pseudo‐Autosomal Region DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các chỉ thị di truyền Y-STR chọn lọc Bảng 1.2: Tóm tắt các kit Y-STR thương mại Bảng 1.3: các cơ sở dữ liệu gen Y-STR trên thế giới Bảng 1.4: Các ứng dụng và thuận lợi khi phân tích Y-STR trong hình sự Bảng 2.1: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao quản Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN từ 10 mẫu nghiên cứu ngẫu nhiên Bảng 3.2: Bảng đa hình các alen quan sát được khi nghiên cứu Bảng 3.3: Tần suất alen 17 locus Y-STR phân tích từ 80 người nghiên cứu Bảng 3.4: Bảng giá trị của Ф st và P giữa quần thể Việt đã nghiên cứu và dữ liệu có sẵn trên YHRD Bảng 3.5: Bảng giá trị Ф st và P giữa quần thể người Việt (Kinh) đã nghiên cứu và quân thể các nước lân cận DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ 2 nhiễm sắc thể giới tính X và Y: Hình 1.2: Trường hợp 2 alen ở locus DYS385a/b Hình 1.3: Hình ảnh khuếch đại ở locus DYS389I/II Hình 1.4: Kết quả điện di của kit Y-PLEX TM 6 Hình 1.5: Hình ảnh pic khi phân tích Y-STR và STR trên NST thường trong mẫu lẫn thành phần nam/nữ Hình 1.6: Hình ảnh cây phả hệ Hình 3.1: Hình ảnh pic 17 locus Y-STR sau điện di huỳnh quang Hình 3.2: Đồ thị mô tả chỉ số đa dạng locus gen hệ 17 Y-STR Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh) Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 1 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng thí nghiệm ADN đã được triển khai từ năm 1999 với trang thiết bị hiện đại và đội ngũ giám định viên được đào tạo chuyên sâu [9]. Lĩnh vực giám định gen được triển khai với 3 mảng lớn là: Giám định ADN trên nhiễm sắc thể thường; giám định gen trên nhiễm sắc thể giới tính và giám định ADN ti thể. Phân tích ADN trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là trên nhiễm sắc thể Y đã đóng góp được những thành tích nhất định như: bổ sung vào bảng locus gen cùng với các locus gen trong phân tích ADN trên nhiễm sắc thể thường, phân tích quan hệ huyết thống cha con, phân tích phả hệ theo dòng bố và đặc biệt hữu ích trong các vụ án dấu vết ít, khó phát hiện như các vụ án hiếp dâm (lẫn thành phần thấp tế bào nam trong thành phần cao tế bào nữ hoặc nhiều đối tượng tham gia vụ án), các vụ án dấu vết bị nhiễm, bị lẫn. Giám định ADN trên nhiễm sắc thể Y là phân tích và so sánh các chỉ thị di truyền là các đoạn lặp ngắn STR (Short Tandem Repeat) trên nhiễm sắc thể Y giữa mẫu cần giám định và mẫu so sánh. Những người có giới tính nam trong cùng một phả hệ theo dòng bố sẽ có cùng một kiểu gen đơn bội trên nhiễm sắc thể Y (gọi là Haplotype), kiểu gen này rất ổn định ngoại trừ đột biến. Do vậy phân tích hệ Y-STR trong giám định gen không có tính truy nguyên cá thể như trên nhiễm sắc thể thường, mà chỉ có tính chất loại trừ trong một số trường hợp. Tuy nhiên phân tích này lại rất hữu ích trong các trường hợp với dấu vết ít, khó phát hiện mà phân tích trên nhiễm sắc thể thường không có tác dụng và một điều quan trọng là trong phần lớn các vụ án bạo lực, hiếp dâm thì đối tượng luôn là nam giới. Nên triển khai giám định ADN trên nhiễm sắc thể Y là một công việc rất ý nghĩa. Sự phát triển của Sinh học phân tử và khoa học thống kê, giúp giám định gen trở thành công cụ Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR của người Việt (Kinh) Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 2 sắc bén trong nghiên cứu ADN nói chung và khoa học hình sự nói riêng. Tuy vậy, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu chi tiết về lĩnh vực này. Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự mới có các công trình về tần suất của các chỉ thị di truyền STR trên nhiễm sắc thể thường (người Kinh, Mường ), còn về tần suất Haplotype chưa có thống kê nào cụ thể. Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài sẽ phân tích các alen thuộc hệ Y-STR trên nhiễm sắc thể Y của 80 người đàn ông Việt (Kinh) khỏe mạnh, không quen biết nhau trước ở các vùng miền của Việt Nam. Sau đó liệt kê được bảng đa hình các alen cho từng locus và xác định số Haplotype hệ Y-STR có thể quan sát được bằng phương pháp đếm. Từ đó tính toán tần suất Haplotype và tính tính chỉ số Haplotype và chỉ số các locus gen. Đề tài nghiên cứu “ Tính toán tần suất Haplotype hệ Y-STR phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự” được tiến hành là hết sức cần thiết và có ý nghĩa cả về khoa học và thực tiễn. [...]... kiểu gen hệ Y- STR từ các mẫu trên 2.2.2.2 Tính toán thống kê Tần suất alen và tần suất haplotype được tính toán theo phương pháp đếm đã nêu ở trên Chỉ số locus và chỉ số haplotype được tính toán theo công thức sau: Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 22 Tính toán tần suất Haplotype hệ Y- STR của người Việt (Kinh) Trong đó N là số lượng cá thể nghiên cứu Pi là tần suất haplotype thứ i Chỉ... 27-32 DYS390 5 20, 23-26 DYS391 4 9-11, 16 DYS392 5 11-15 DYS393 4 12-15 Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 25 Tính toán tần suất Haplotype hệ Y- STR của người Việt (Kinh) DYS438 4 9-12 DYS439 4 11-14 DYS437 2 14-15 DYS448 6 15, 17- 21 DYS456 5 13 -17 DYS458 8 14-21 DYS635 7 19-26 YGATH4 5 10-14 DYS438 4 9-12 DYS385 31 (11-12)-(18-20) Bảng 3.3: Tần suất alen 17 locus Y- STR phân tích từ 80 ngƣời... n y đã có hơn 200 Y- STR mới được gửi vào cơ sở dữ liệu gen (GDB; http://www.gdb.org) Tuy nhiên, để thuận tiện các nhà khoa học chỉ chọn một số lượng có hạn các locus để tiến hành Năm 1997 người ta đã chọ các locus DYS19, DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, và DYS385a/b Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 5 Tính toán tần suất Haplotype hệ Y- STR của người Việt (Kinh) để x y. .. DYS 393 8-16 AGAT DYS 391 7-13 TCTA DYS 439 8-15 AGAT DYS 635 20-26 TSTA DYS 392 7-18 TAT Y GATA H4 8-13 TSTA DYS 437 13 -17 TCTA DYS 438 8-13 TTTTC DYS 448 17- 24 AGAGAT Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 6 Tính toán tần suất Haplotype hệ Y- STR của người Việt (Kinh) Đặc biệt, ở một số locus trên nhiễm sắc thể Y có nhiều hơn 1 alen Thực tế n y dẫn tới nhầm lẫn khi đếm số locus trên một haplotype. .. DYS389I/II Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 7 Tính toán tần suất Haplotype hệ Y- STR của người Việt (Kinh) 1.4 Các bộ kít thƣơng mại phân tích nhiễm sắc thể Y Các nhà khoa học hình sự chủ y u dựa vào các bộ kít thương mại để giám định ADN Bộ đầu tiên được sử dụng là Y- PLEXTM6 của hãng ReliaGene Technologies (NewOrleans LA), đồng khuếch đại DYS19, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS393 và DYS385a/b... được, chúng tôi đã tính toán tần suất từng alen và tần suất của haplotype phân tích được (kết quả được trình b y trong phụ lục), cho th y: Chúng tôi thu được 56 alen ở 17 locus Y- STR, 77 Haplotype duy nhất và 3 haplotype được tìm th y 2 lần Chỉ số đa dạng haplotype là 0,9994 Chỉ thị di truyền đa hình nhất là DYS385a/b, chỉ số đa dạng locus là 0,943 và chỉ thị di truyền it đa hình nhất là DYS438 với chỉ... dịch âm đạo thu từ các vụ án thì họ đã phân tích được khoảng 29% các mẫu n y Tại Viện Khoa học hình sự, phân tích ADN hệ Y- STR chưa có điều kiện nghiên cứu sâu vì những lý do: (1) Kinh phí cho nghiên cứu là khá lớn, (2) Các vụ việc còn khiêm tốn, khi cơ quan điều tra chủ y u là khai thác rõ về truy nguyên cá thể Hiện nay tại Viện, phân tích Y- STR chủ y u phục vụ giám định huyết thống theo dòng bố,... Hiện n y ABI bổ sung thêm 5 locus là DYS437, DYS448, DYS456, DYS458 và DYS635 Hiện nay, phổ biến trên thế giới và Viện Khoa học hình sự cũng đã áp dụng là bộ chỉ thị di truyền 17 Y- STR (bảng 1.1).[9] Bảng 1.1: Các chỉ thị di truyền Y- STR chọn lọc Locus Số lƣợng alen Đoạn lặp DYS456 13-18 AGAT DYS389I 10-15 TCTA DYS 390 18-27 TCTA DYS 389 II 24-34 (TCTG) (TCTA) DYS 458 14-20 GAAA DYS 19 10-19 TAGA DYS 385a/b... và tính toán tần suất Y- STR haplotype Sau khi có đ y đủ kiểu gen hệ Y- STR của 80 người nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm để quan sát tính đa hình alen trên từng locus và tính toán chỉ số đa hình locus và đa dạng haplotype, cho kết quả như sau: Bảng 3.2: Bảng đa hình các alen quan sát đƣợc khi nghiên cứu Locus Y- STR Số alen quan sát alen DYS19 6 13-18 DYS389I 5 11-15 DYS389II 6 27-32 DYS390... sở dữ liệu YHRD ra đời đã giải quyết được 4 mục tiêu chính sau: (1) Thiết lập ngân hàng thông tinh tiêu chuẩn về trình tự Y- STR (2) Đưa ra một tiêu chuẩn cho giám định gen phục vụ pháp lý (3) Đánh giá mức độ phân bố của quần thể (4) ước tính được một khoảng tinh c y cho tần số haplotype Y- STR phục vụ trong giám định gen hình sự Tính đến ng y 30 tháng 12 năm 2010, cơ sở dữ liệu YHRD đã x y dựng được . locus gen hệ 17 Y- STR Tính toán tần suất Haplotype hệ Y- STR của người Việt (Kinh) Vũ Lê Lợi – Trung tâm giám định Sinh học pháp lý 1 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng. Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VŨ LÊ LỢI TÍNH TOÁN TẦN SUẤT HAPLOTYPE HỆ 17 Y- STR PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM. hệ Y- STR phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự được tiến hành là hết sức cần thiết và có ý nghĩa cả về khoa học và thực tiễn. Tính toán tần suất Haplotype