Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ THÀNH CÔNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHENOL CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TẠO MÀNG SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các kết quả trong luận văn là trung thực và là các kết quả thực tế do chúng tôi nghiên cứu, chƣa từng đƣợc công bố trong các công trình khác. Các tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng và đƣợc trích dẫn đầy đủ. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2014 Học viên Lê Thành Công Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các anh chị cán bộ Phòng Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt là TS. Lê Thị Nhi Công, ThS. Cung Thị Ngọc Mai, ThS. Vũ Thị Thanh, CN. Vũ Hải Hà đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình hoàn thành luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học, đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trưởng Khoa Khoa học sự sống đã tạo điều kiện, giới thiệu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè và người thân đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Với tất cả những tình cảm và lòng biết ơn chân thành sâu sắc, tôi xin cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014 Học Viên Lê Thành Công iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý, hóa học của phenol 3 1.1.1. Cấu trúc phenol 3 1.1.2. Tính chất vật lý 3 1.1.3. Tính chất hóa học 3 1.2. Tổng quan về tình hình ô nhiễm phenol trên thế giới và Việt Nam 5 1.2.1. Trên thế giới 5 1.2.2. Ở Việt Nam 5 1.3. Ảnh hƣởng của phenol tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời 6 1.3.1. Ảnh hƣởng tới môi trƣờng 6 1.3.2. Ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời 7 1.4. Biện pháp xử lý ô nhiễm phenol 9 1.4.1. Biện pháp cơ học 9 1.4.2. Biện pháp vật lý 9 1.4.3. Biện pháp hóa học 10 1.4.4. Biện pháp sinh học 10 1.5. Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm) 16 iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.5.1. Định nghĩa 16 1.5.2. Sự hình thành biofilm 18 1.5.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sự hình thành biofilm 19 1.6. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật 20 1.6.1. Phân loại vi sinh vật theo phƣơng pháp truyền thống 20 1.6.2. Phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử 20 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị sử dụng 22 2.1.1. Nguyên liệu 22 2.1.2. Hoá chất, môi trƣờng 22 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Thu thập mẫu 24 2.2.2. Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng chứa phenol 24 2.2.3. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng phenol 25 2.2.4. Đánh giá và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 26 2.2.5. Phân loại và định tên một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 27 2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng sinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành 30 2.2.7. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo thành ở điều kiện tối ƣu 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Thu thập mẫu và phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol 33 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.1.1. Thu thập mẫu 33 3.1.2. Phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol 33 3.1.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt 36 3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu 37 3.2. Phân loại và định tên 3 chủng tạo biofilm tốt 38 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số 38 3.2.2. Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 39 3.3. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng sinh học 41 3.3.1. Ảnh hƣởng của pH 41 3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 42 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 43 3.3.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitor 44 3.4. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm đa chủng tạo thành ở điều kiện tối ƣu 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 PHỤ LỤC 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ phenol 6 Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của phenol đến sức khoẻ của con ngƣời và động vật 8 Bảng 1.3. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ sinh học phenol 12 Bảng 2.1. Các môi trƣờng nuôi cấy 22 Bảng 2.2. Các thành phần của phản ứng PCR 28 Bảng 3.1. Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng vi khuẩn 37 vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của phenol 3 Hình 1.2. Con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho bởi 13 Hình 1.3. Con đƣờng phân hủy sinh học kỵ khí phenol bởi Pseudomonas sp. 14 Hình 1.4. Cấu trúc của biofilm qua ảnh hiển vi quét 18 Hình 1.5. Sự hình thành biofilm 19 Hình 2.1. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 29 Hình 3.1. Mẫu nƣớc (A) và mẫu bùn (B) thu thập đƣợc từ bể chứa nƣớc thải kho xăng dầu Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội 33 Hình 3.2. Mẫu làm giàu vsv trên môi trƣờng khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol 34 Hình 3.3. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng khoáng Gost thạch 35 Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn 36 Hình 3.5. Khả năng tạo biofilm của 8 chủng vi khuẩn 36 Hình 3.6. Khả năng tạo màng của 8 chủng vi khuẩn 37 Hình 3.7. Hình ảnh điện di DNA tổng số 3 chủng vi khuẩn 39 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn 39 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 40 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 42 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 43 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn 44 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitor lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn 45 Hình 3.14. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của màngsinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành ở các nồng độ phenol khác nhau 46 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy 150 ppm phenol của màng sinh học đa chủng của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm sau 7 ngày xử lý 47 ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BẢNG CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid EPS : Extracellular Polymeric Substances (hợp chất ngoại bào) h : hour (giờ) kDa : KiloDalton LB : Luria-Bertani LD50 : Lethal Dose, 50% (liều lƣợng gây chết một nửa) mg, g : milligram, gram OD : Optical Density (mật độ quang học) GAC : Granular Activated Carbon (than hoạt tính dạng hạt) PAC : Powder Activated Carbon (than hoạt tính dạng bột) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) ppm : parts per million (đơn vị một phần triệu, mg/l) RNA : Ribonucleic acid vsv : Vi sinh vật nm, µm, cm, mm : Nanometer, micrometer, centimeter, milimeter µl, ml, l : Microliter, milliliter, liter HKTS : Hiếu khí tổng số PAH : Polycyclic Aromantic Hydrocarbons [...]... màng sinh học tốt từ các mẫu nghiên cứu lấy từ kho xăng dầu Đức Giang- Gia Lâm- Hà Nội Đánh giá khả năng phân huỷ và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên Nội dung của đề tài: 1 Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ phenol 2 Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học 3 Phân loại và định tên một số chủng vừa có khả năng tạo biofilm tốt, vừa có khả năng. .. phân hủy các chất ô nhiễm tốt hơn Do vậy, để góp phần xử lý các nguồn ô nhiễm phenol, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân huỷ phenol của một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học Mục tiêu của đề tài: Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân huỷ phenol cao, vừa tạo màng. .. vừa có khả năng phân hủy phenol cao 4 Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng phân huỷ phenol của các chủng nghiên cứu 5 Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo thành ở điều kiện tối ƣu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc, tính chất vật lý, hóa học của phenol 1.1.1 Cấu trúc phenol Phenol còn đƣợc... và phenol nói riêng theo phƣơng pháp phân huỷ sinh học đang là một hƣớng đi mới đầy triển vọng và thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và trong nƣớc Bản chất của phƣơng ph Một trong các phƣơng pháp phân huỷ sinh học đƣợc ứng dụng hiện nay là công nghệ màng sinh học (biofilm) do các vi sinh vật tạo ra Bản chất của biofilm là một tập hợp các vi sinh vật gắn trên một bề mặt của. .. sự phân hủy sinh học phenol còn phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các phenol, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của phenol và các dẫn xuất của chúng trong môi trƣờng Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phƣơng thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào Thƣờng những phân tử có khả năng hòa tan trong nƣớc có thể đƣợc vận chuyển qua màng tế bào và dễ dàng phân hủy. .. các vi sinh vật thƣờng xảy ra với tốc độ chậm Do vậy, vi c tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát triển tốt nhất có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học Khi các tập đoàn vi sinh vật phát triển, sẽ dần hình thành một cấu trúc bền vững đó là màng sinh học 1.5 Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm) 1.5.1 Định nghĩa Màng sinh học (biofilm) là một tập hợp các vi sinh. .. tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 21 phân loại vi sinh vật đó là phân loại học phân tử” Phƣơng pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao Trƣớc đây, vi c phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với vi c phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, vi c phân. .. hóa học để nâng cao quá trình phân hủy sinh học phenol * Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm phenol Quá trình chuyển hóa đƣợc thực hiện bởi hoạt động của các enzyme do các chủng vi sinh vật khác nhau tiết ra Mỗi loại enzyme chỉ đặc trƣng cho mỗi loại phản ứng, do đó để xử lý phenol đƣợc triệt để, phải kết hợp nhiều chủng vi sinh vật khác nhau Nhiều loài vi khuẩn và nấm men có khả năng. .. chất và chất xúc tác…[20] Kích thích sinh học hiện đang là khuynh hƣớng đƣợc sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng bằng phƣơng pháp phân hủy sinh học [22] Từ nguồn ô nhiễm, ngƣời ta có thể phân lập ra một số chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng phenol Sau đó nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chúng để tìm ra các điều kiện tối ƣu cho sự phát triển của chúng trên nguồn cơ chất phenol. .. E7: Hydrotase, E8: Aldose  Phân hủy kỵ khí phenol Các vi sinh vật phân hủy kỵ khí phenol trong điều kiện kỵ khí đã đƣợc nghiên cứu với vi khuẩn khử nitor Thauera aromatic Sự phân hủy kỵ khí bắt đầu từ quá trình carboxyl hóa phenol, trải qua các bƣớc: (1) Quá trình phosphoryl hóa phenol: một nhóm phosphate (từ một phosphoryl nào đó), đƣợc gắn vào phân tử phenol dƣới xúc tác của phosphate phenyl synthase . giá khả năng phân huỷ và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên. Nội dung của đề tài: 1. Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ phenol. 2. Tuyển chọn một số chủng. khả năng sử dụng phenol 25 2.2.4. Đánh giá và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 26 2.2.5. Phân loại và định tên một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 27 2.2.6. Nghiên cứu. một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học. 3. Phân loại và định tên một số chủng vừa có khả năng tạo biofilm tốt, vừa có khả năng phân hủy phenol cao. 4. Nghiên cứu một số điều kiện