Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM o0o VŨ LAN ANH XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH TẾ BÀO TRẦN TỪ MÔ S ẸO PHÔI HOÁ CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QU Ả CÓ MÚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. ðỗ Năng Vịnh HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 2 LỜI CÁM ƠN Lời ñầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc ñến GS. TS. ðỗ Năng Vịnh, người ñã quan tâm, chỉ bảo và hướng dẫn tôi rất tận tình ñể hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới thầy cô giáo lớp cao học K16, ñã giúp ñỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn trong suốt thời gian học cao học. Tôi xin cám ơn TS. Hà Thị Thuý, cùng toàn thể các cô chú, các anh chị và các bạn ñồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di Truyền Nông Nghiệp ñã giúp ñỡ tôi trong công việc cũng như quá trình viết luận văn. Cuối cùng, tôi xin ñược gửi lời cám ơn sự ủng hộ, ñộng viên khích lệ của gia ñình và bạn bè trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn. Vũ Lan Anh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 3 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan luận văn là kết quả nghiên cứu hoàn toàn chính xác và trung thực. Nội dung luận văn có ñược tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin ñược ñăng tải và công bố trên các tác phẩm, tạp chí và các webside theo danh mục tài liệu của luận văn. Kết quả trình bày trong luận văn ñược xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê với ñộ tin cậy cao. Vũ Lan Anh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 4 MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cảm ơn ii Lời cam ñoan iii Mục lục iv Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng viii Danh mục các hình vẽ, ñồ thị ix MỞ ðẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu về cây ăn quả có múi 4 1.1.1. Phân loại 4 1.1.2. Nguồn gốc 5 1.1.3. Các giống cây ăn quả có múi trồng phổ biến ở trong nước 7 1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới và trong nước 8 1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới 8 1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở nước ta 11 1.3. Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trong nước 12 1.4. Tình hình nghiên cứu cây ăn quả có múi trên thế giới 13 1.5. Cơ sở khoa học - Nguyên lý của quá trình phát sinh phôi soma 14 1.5.1. Quá trình phát sinh phôi soma gián tiếp qua callus 15 1.5.2. Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình tạo mô sẹo phôi hoá ở giống cây có múi 18 1.6. Tách và nuôi tế bào trần ở citrus 23 1.6.1. Lịch sử phát triển của phương pháp tách nuôi và tái sinh tế bào trần 23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 5 1.6.2. Các phương pháp tách tế bào trần từ các nguồn mẫu khác nhau 24 1.6.3. Thành công trong nghiên cứu hệ thông tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá ở citrus 25 1.6.4. Những ứng dụng trong nghiên cứu hệ thông tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá ở citrus 26 1.7. Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá 30 1.7.1. Tạo phôi vô tính ở cây ăn quả có múi 30 1.7.2. Tái sinh cây từ phôi vô tính 31 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Vật liêu nghiên cứu 32 2.2. Nội dung nghiên cứu 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá của 2 giống cam Sành và Valencia 33 2.3.2. Nhân sinh khối nguồn mô sẹo phôi hoá 35 2.3.3. Phương pháp tách và tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá 37 2.3.4. Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá ở hai giống citrus 38 2.3.5. Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu 41 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 3.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá của 2 giống cam Sành và Valencia 42 3.1.1. Nghiên cứu khử trùng mẫu 42 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của CðHST ñến tạo callus 44 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 6 3.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dạng mẫu và tuổi mẫu nuôi cấy ñối với tạo mô sẹo phôi hoá 47 3.2. Nhân sinh khối nguồn mô sẹo phôi hoá 50 3.2.1. Ảnh hưởng của các chất ñiều hoà sinh trưởng ñến nhân sinh khối callus của hai giống citrus 50 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng Malt extract 51 3.2.3. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng lắc ñến nhân sinh khối callus của hai giống cây ăn quả có múi 53 3.2.4. So sánh hệ số nhân sinh khối callus giữa nuôi cấy lỏng lắc thông thường với nhân sinh khối thông qua hệ thống Bioreacter 58 3.3. Tách và nuôi cấy tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá 60 3.4. Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá ở hai giống citrus 63 3.4.1. Tạo phôi vô tính từ tế bào trần nguồn gốc mô sẹo phôi hoá của hai giống citrus 63 3.4.2. Tái sinh cây từ phôi vô tính 70 3.5. Kết quả ñưa cây ra vườn ươm 76 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 7 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D: 2,4 Dichlorophenoxy acetic acid α-NAA: α-Naphtalene acetic acid BAP: Benzyl amino purine EC: Embryogenic cell NEC: Non – embryogenic cell ME: Malt extract CCC Clocolinclorit CðHST Chất ñiều hoà sinh trưởng MS Murashige và Skoog ABA Axit abxixic Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 8 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các giống thương mại chính ñược trồng ở nước ta 7 1.2 Quá trình phát sinh phôi ở cây một lá mầm và hai lá mầm 17 3.1 Ảnh hưởng của H 2 O 2 với thời gian và nồng ñộ khác nhau ñến hiệu quả khử trùng 43 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến sự hình thành callus của cam Sành 45 3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến sự hình thành callus cam Valencia 46 3.4 Ảnh hưởng của dạng mẫu ñối với tạo mô sẹo phôi hoá 47 3.5 Ảnh hưởng BAP và kinetin ñến nhân sinh khối callus 50 3.6 Ảnh hưởng của ME ñến nhân sinh khối ở hai giống cam Sành và cam Valencia 52 3.7 Ảnh hưởng của thể tích môi trường khác nhau ñến nhân sinh khối callus của cam Sành và cam Valencia 54 3.8 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc khác nhau ñến nhân sinh khối callus của cam Sành và cam Valencia 56 3.9 So sánh hệ số nhân sinh khối callus giữa nuôi cấy lỏng lắc thông thường với nhân sinh khối thông qua hệ thống Bioreacter 59 3.10 Số phôi vô tính hình thành trên các môi trường tạo phôi khác nhau 64 3.11 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng lắc ñến hình thành phôi vô tính 66 3.12 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau ñến sự nảy mầm của phôi vô tính 71 3.13 Ảnh hưởng của nước dừa và ME ñến tỷ lệ nảy mầm của phôi vô tính ở cam Sành và cam Valencia 74 3.14 Ảnh hưởng của loại giá thể ñến tỉ lệ sống của cây ngoài vườn ươm 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 9 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Tổng sản lượng Citrus của các nước chính 9 2.1 Mẫu quả non và lát cắt ngang quả non dùng trong thí nghiệm 33 3.1 Ảnh hưởng của H 2 O 2 với thời gian và nồng ñộ khác nhau ñến hiệu quả khử trùng mẫu 43 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4 D + BAP và 2,4-D + kinetin ñến sự hình thành callus cam Sành và cam Valencia 46 3.3 Callus cam Valencia trên môi trường có bổ sung CðHST khác nhau 47 3.4 Ảnh hưởng của dạng mẫu nuôi cấy ñối với tạo mô sẹo phôi hoá 48 3.5 Mô sẹo thu ñược từ noãn cam Sành 48 3.6 Callus trên môi trường bổ sung 2mg/l BAP 51 3.7 Ảnh hưởng của ME ñến nhân sinh khối ở hai giống cam Sành và cam Valencia 53 3.8 Sinh khối của callus trên môi trường bổ sung 0,5mg/l ME 53 3.9 Ảnh hưởng của thể tích môi trường ñến nhân sinh khối callus của hai giống cam Sành và cam Valencia 55 3.10 Sinh khối callus cam Sành trong môi trường lỏng lắc với thể tích khác nhau 55 3.11 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc và thể tích môi trường khác nhau ñến nhân sinh khối callus của cam Sành và cam Valencia 57 3.12 Mô sẹo phôi hoá trong các ñiều kiện nuôi cấy khác nhau 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 10 3.13 Hình ảnh tế bào trần 62 3.14 Phôi hình thành trên các môi trường có bổ sung các loại ñường khác nhau 65 3.15 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau ñối với sự tạo phôi vô tính từ mô sẹo phôi hoá 65 3.16 Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng lắc ñến hình thành phôi vô tính ở hai giống cam Sành và cam Valencia 67 3.17 Phôi cam Sành hình thành trên môi trường lỏng 67 3.18 Quá trình phát sinh phôi từ callus phôi hoá của Cam sành và Cam Valencia 69 3.19 Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau ñến sự nảy mầm của phôi vô tính 72 3.20 Nảy mầm của phôi vô tính trên môi trường có bổ sung CðHST 72 3.21 Ảnh hưởng của nước dừa và ME ñến tỷ lệ nảy mầm của phôi vô tính ở cam Sành và cam Valencia 75 3.22 Ảnh hưởng của nước dừa ñến nảy mầm và phát triển của phôi vô tính ở cam Valencia 75 3.23 Ảnh hưởng của loại giá thể ñến tỉ lệ sống của cây con 77 3.24 Cây con ngoài vườn ươm 77 [...]... Swingle) ñã tái sinh ñư c cây c a mô s o phôi hoá [11] Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c nông nghi p…………… 29 Nh ng n l c t o mô s o phôi hoá chưa thành công, nguyên nhân có th do các gi ng có múi ñơn phôi v n các gi ng có múi ñơn phôi thi u phôi tâm ho c các t bào m m [36] Tuy nhiên m i ñây Ling (1997) ñã t o ñư c mô s o phôi hoá t phôi h p t c a gi ng có múi ñơn phôi Hơn th... t bào ñư c xác ñ nh có kh năng phôi hóa do c m ng) ñ mô t t bào phôi hóa có ngu n g c t t bào không phôi hóa; còn các t bào hình thành t phôi ñã có s n chương trình bi u hi n gen phôi hóa ñư c g i là PEDC (Pre-Embryogenic Determined Cell- t bào ñư c xác ñ nh có kh năng ti n phôi hóa) Vì v y, tùy theo t ng ki u t bào mà có hai con ñư ng phát sinh phôi soma [44, 64, 52] Tuy nhiên, dù là ki u phát sinh. .. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c nông nghi p…………… 11 bào tr n t mô s o phôi hoá Các nhà ch n gi ng cây có múi ñã nghiên c u t o ñư c ngu n t bào tr n t các mô khác nhau cây có múi như t bào th t lá, mô s o phôi hoá, mô s o không phôi hoá, t bào t t (Tetrads) K t ñây tái sinh cây t t bào tr n ñã th c hi n ñư c r t nhi u gi ng và loài citrus [28, 35, 29] Trong s các gi ng ñư... th c hi n ñ tài: Xây d ng h th ng tái sinh t bào tr n t mô s o phôi hoá c a m t s gi ng cây ăn qu có múi M c ñích nghiên c u - Xây d ng quy trình t o mô s o phôi hoá in vitro gi ng cam Sành và cam Valencia làm v t li u t t cho tách và nuôi c y t bào tr n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c nông nghi p…………… 12 - Xây d ng ñư c phương pháp tái sinh cây t t bào tr n hai gi ng... t bào (hay d ch l ng t bào = Suspension cells) phôi hoá Nuôi c y phôi hoá huy n phù kh i ngu n t callus có ngu n g c t noãn, cung c p m t ngu n t bào tr n t i ưu s d ng cho dung h p Nuôi c y như v y có th ñư c duy trì trong môi trư ng không có ch t ñi u hoà sinh trư ng [28] ho c trong môi trư ng ch a BA cao [50] 1.6.2.2 T t bào mô s o phôi hoá có ngu n g c t mô phôi tâm ho c các mô c a hoa non T bào. .. i th t ch i ng c a cây già, h t non, mô s o phôi hoá và c m ch i in vitro các loài và gi ng cây ăn qu có múi khác nhau b Xây d ng ñư c quy trình t o và nhân nhanh mô s o phôi hoá, phôi vô tính và cây con t c y mô các gi ng cây ăn qu có múi b n ñ a khác nhau dùng trong nghiên c u ña b i hoá, bi n d và làm v t li u cho dung h p t bào tr c ðã t o ñư c các dòng t b i có giá tr , g m t b i th cam Sành, cam... 1977, ngư i ta ñã tách nuôi t bào tr n t mô s o phôi hoá c a gi ng cam này và ñã tái sinh ñư c cây cam ñ u tiên t t bào tr n [62, 27] ð n nay, tái sinh cây t t bào tr n ñã ñư c th c hi n thành công r t nhi u gi ng và loài Citrus Năm 1985, các nhà khoa h c Nh t B n [50] l i thành công trong dung h p t bào tr n c a 2 loài cây ăn qu có múi khác nhau và ñã tái sinh ñư c cây lai t t bào dung h p gi a gi ng cam... – Lu n văn th c s khoa h c nông nghi p…………… 27 Nh ng thí nghi m nuôi c y mô ñ u tiên th c hi n cây có múi ñã t o thành công phôi vô tính t mô phôi tâm nh m m c ñích tái sinh cây s ch b nh [54, 55] T m c ñích ban ñ u này ngày nay mô s o phôi hoá - phôi vô tính là ngu n th c li u ñư c s d ng r ng rãi trong các chương trình ch n t o gi ng cây có múi, như ch n l c bi n d dòng vô tính, tái sinh cây s ch... là lai t bào sinh dư ng ho c lai t bào sôma) Citrus Trong ñó m t trong 2 lo i t bào dùng ñ lai ph i có ngu n g c t mô s o phôi hoá, vì ch t bào mô s o phôi hoá ho c t bào lai v i nó m i có kh năng tái sinh thành cây in vitro Sau ñó cây lai t bào tr n ñã ñư c t o ra nhi u c p lai khác loài trong chi Citrus như: Cây lai sôma khác loài ñư c t o ra gi a gi ng cam ng t ăn tươi n i ti ng Washington Navel)... ng m u này ch tái sinh ñư c ch i ho c cây [21, 20] 1.5.2.3 nh hư ng c a môi trư ng nuôi c y ñ i v i t o mô s o phôi hoá Nhìn chung các auxin t ng h p như 2,4-D, picloram và dicamba thư ng ñư c s d ng ñ t o mô s o phôi hoá Tuy nhiên, nhi u loài th c v t b c cao loài có múi mô s o phôi hoá có th ñư c t o ra khi s d ng cytokinin và m t s ch t ph gia khác r t quan tr ng cho t o mô s o phôi hoá Trư ng ð . thông tái sinh tế bào trần từ mô sẹo phôi hoá ở citrus 26 1.7. Nghiên cứu tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá 30 1.7.1. Tạo phôi vô tính ở cây ăn quả có múi 30 1.7.2. Tái. bào trần từ mô sẹo phôi hoá. Các nhà chọn giống cây có múi ñã nghiên cứu tạo ñược nguồn tế bào trần từ các mô khác nhau ở cây có múi như tế bào thịt lá, mô sẹo phôi hoá, mô sẹo không phôi hoá, . tái sinh cây từ tế bào trần có nguồn gốc mô sẹo phôi hoá ở hai giống citrus 63 3.4.1. Tạo phôi vô tính từ tế bào trần nguồn gốc mô sẹo phôi hoá của hai giống citrus 63 3.4.2. Tái sinh cây