BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  BÙI NGỌC TRANG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH PHỤC VỤ CHO TẠO GIỐNG MÍA (SACCHARUM SSP.) CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS LÊ HUY HÀM HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i Lời cam ñoan Tôi xin cam ñoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa sử dụng ñể bảo vệ trong một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong luận văn này ñã ñược cảm ơn, mọi thông tin trích trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 09 năm 2008 Tác giả Bùi Ngọc Trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii Lời cảm ơn ðể hoàn thành luận văn, tôi nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của mọi người. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các Thầy giáo, Cô giáo khoa Nông học, khoa Sau ðại học,bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc nhất tới Thầy giáo - PGS.TS. Lê Huy Hàm, người ñã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp ñỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu cùng tập thể cán bộ công nhân viên Viện Di truyền Nông nghiệp ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi hoàn thành khoá học! Hà Nội, tháng 09 năm 2008 Tác giả Bùi Ngọc Trang Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip iii MC LC Li cam ủoan i Li cm n ii Mc lc iii Bng kớ hiu cỏc ch vit tt vi Danh mc bng vii Danh mc biu ủ ix Danh mc hỡnh x 1. Mở đầu 1 1.1 đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 3 1.2.1 Mục đích 3 1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3 1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 1.3.1 ý nghĩa khoa học 3 1.3.2 ý nghĩa thực tiễn 3 2. Tổng quan tài liệu 4 2.1 Một số nét về cây mía (Saccharum Ssp.) 4 2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học 4 2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái 5 2.1.3 Giá trị cây mía 6 2.2 Cơ sở khoa học của xây dựng hệ thống tái sinh 7 2.2.1 Cơ sở khoa học 7 2.2.2 Vai trò của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng cho biến nạp gen 8 2.3 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật 11 2.3.1 Khái niệm về chuyển gen 11 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip iv 2.3.2 Các phơng pháp chuyển gen 11 2.3.3 Vai trò của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen 14 2.4 Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào cây mía 15 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15 2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19 3. nội dung, vật liệu và Phơng pháp nghiên cứu 22 3.1 Nội dung nghiên cứu 22 3.2.1 Vật liệu thực vật 22 3.2.2 Vật liệu di truyền 24 3.3 Phơng pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Môi trờng nuôi cấy 25 3.3.2 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 25 3.3.3 Bố trí thí nghiệm 25 3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 33 3.3.5 Xử lý số liệu 34 4. Kết quả và thảo luận 35 4.1 Đánh giá khả năng tái sinh cây thông qua mô sẹo của 4 giống mía nhập nội 35 4.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía 35 4.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng tái sinh của 4 giống mía 38 4.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 40 4.2.1 Giai đoạn khởi tạo và nhân mô sẹo 40 4.2.2 Giai đoạn tái sinh, nhân chồi và ra rễ 50 4.2. 3 Giai đoạn vờn ơm 62 4.3 Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị GUS vào mô sẹo của cây mía thông qua Agrobacterium tumefaciens 64 4.3.1 Thí nghiệm 13. Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen vào mô sẹo mía 65 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip v 4.3.2 Thí nghiệm 14. Nghiên cứu ảnh hởng của mật độ vi khuẩn đến mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía 66 4.3.3 Thí nghiệm 15. Nghiên cứu ảnh hởng của AS tới khả năng biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía 67 4.3.4 Thí nghiệm 16. Nghiên cứu ảnh hởng của thời gian lây nhiễm tới khả năng biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía 69 5. Kết luận và đề nghị 72 5.1 Kết luận 72 5.2 Đề nghị 73 tàI LIệU THAM KHảO 76 pHụ LụC 82 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip vi Bảng kí hiệu các chữ viết tắt Đ/C : Đối chứng ĐTST : Điều tiết sinh trởng 2,4-D : 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid ADN : Acid deoxy ribo nucleic AS : Acetosyringone BAP : 6-Benzylaminopurine CS. : Cộng sự CV : Correlation of Variants gus : -glucuronidase IAA : Indole-3-acetic acid Ki : Kinetin (6-Furfurylaminopurine) LSD : Least Significant Difference MS : Murashige và Skoog, 1962 N6 : Chu và cộng sự, 1975 OD 600 : Mật độ vi khuẩn đo ở bớc sóng 600 nm PCR : Polymerase Chain Reaction QĐ : Quế đờng ROC : Republic of China T-DNA : Transfered-DNA TDZ : Thidiazuron VIR : virulence X-Gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronic acid -NAA : -Naphtalenacetic acid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía 27 Bảng 2. ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía 27 Bảng 3. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 28 Bảng 4. ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 29 Bảng 5. Khả năng tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 36 Bảng 6. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống giống mía nhập nội 38 Bảng 7. ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo 41 Bảng 8. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D tới khả năng tạo mô sẹo 44 Bảng 9. ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trê n hai nền môi trường MS và N6 46 Bảng 10. ảnh hưởng của hàm lượng 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên nền môi trường N6 48 Bảng 11. ảnh hưởng của Ki và BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 50 Bảng 12. ảnh hưởng của α-NAA phối hợp Ki tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 54 Bảng 13. ảnh hưởng của Ki ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 56 Bảng 14. ảnh hưởng phối hợp của auxin và Ki lên khả năng nhân nhanh chồi mía 58 Bảng 15. ảnh hưởng của α-NAA lên khả năng phát sinh rễ của chồi mía 60 Bảng 16. ảnh hưởng giá thể ñến Tỉ lệ sống của cây mía ngoài vườn ươm 62 Bảng 17. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumerfaciens thích hợp cho chuyển gen vào mô sẹo giống ROC 23 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii Bảng 18. ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời củ a gen gus ở mô sẹo cây mía 66 Bảng 19. ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời 68 của gen gus 68 Bảng 20. ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỉ lệ biểu hiện 69 tạm thời của gen gus 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC BIỂU ðỒ Biểu ñồ 1. Khả năng tạo mô sẹo của 4 giống mía 37 Biểu ñồ 2. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống mía 40 Biểu ñồ 3. ảnh hưởng của auxin tới khả năng khởi tạo mô sẹo của cây mía 42 Biểu ñồ 4. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D 44 tới khả năng tạo mô sẹo cây mía 44 Biểu ñồ 5. Tương quan giữa nồng ñộ 2,4D và khả năng nhân mô sẹo trên hai nền môi trường MS, N6 47 Biểu ñồ 6. Tương quan giữa nồng ñộ 2,4-D và hệ số nhân mô sẹo của cây mía 49 Biểu ñồ 7. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 51 Biểu ñồ 8. Tương quan giữa nồng ñộ α-NAA trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây mía 54 Biểu ñồ 9. Tương quan giữa nồng ñộ Ki và khả năng nhân nhanh chồi mía 57 Biểu ñồ 10. Tương quan giữa nồng ñộ auxin trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới khả năng nhân nhanh chồi mía 58 Biểu ñồ 11. Tương quan giữa nồng α-NAAvà khả năng phát sinh rễ 61 của chồi mía 61 [...]... gi nào nghiên c u xây d ng h th ng tái sinh ph c v cho t o gi ng mía b ng phương pháp chuy n gen Xu t phát t th c t trên, chúng tôi ti n hành th c hi n ñ Nghiên c u xây d ng h th ng tái sinh ph c v tài: cho t o gi ng mía (Saccharum ssp. ) chuy n gen" Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 2 1.2 M C ðÍCH VÀ YÊU C U C A ð TÀI 1.2.1 M c ñích Nghiên c u xây d... b n gen [13]; Tác gi Lã Tu n Nghĩa và c ng s ñã chuy n gen GUS và gen kháng kanamycin vào cà chua [51]… 2.4 CÁC NGHIÊN C U XÂY D NG H TH NG TÁI SINH VÀ CHUY N GEN VÀO CÂY MÍA 2.4.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i • Các nghiên c u xây d ng h th ng tái sinh Ngày nay, nghiên c u v cây mía ñã ñư c nhi u qu c gia quan tâm, nh t là các nư c nhi t ñ i và á nhi t ñ i- nơi kh i ngu n c a cây mía Nh ng nghiên. .. th ng tái sinh cây mía (Saccharum ssp. ) ph c v cho t o gi ng mía chuy n gen- làm cơ s cho ch n t o gi ng mía năng su t cao, ch t lư ng t t,ch ng ch u nh ng ñi u ki n b t thu n 1.2.2 Yêu c u c a ñ tài - ðánh giá kh năng t o mô s o t lá non và tái sinh cây c a 4 gi ng mía nh p n i - Nghiên c u nh hư ng c a ch t ñi u ti t sinh trư ng t i kh năng hình thành, duy trì và nhân mô s o t o nguyên li u cho chuy... ng tái sinh và chuy n gen cây mía 1.3.2 Ý nghĩa th c ti n Nghiên c u xây d ng h th ng tái sinh và chuy n gen t o cơ s cho vi c chuy n các gen mang các ñ c tính có giá tr vào cây mía Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 3 2 T NG QUAN TÀI LI U 2.1 M T S NÉT V CÂY MÍA (SACCHARUM SSP. ) 2.1.1 Phân lo i và ñ c ñi m th c v t h c Theo phân lo i th c v t, cây mía. .. h th ng tái sinh và m t s h th ng nuôi c y s d ng cho bi n n p gen Trong quá trình chuy n gen th c v t, vi c xây d ng ñư c d ng t bào ñích có kh năng ti p nh n gen m i và tái sinh thành cây hoàn ch nh là h t s c quan tr ng Vì v y, h th ng tái sinh là ñi u ki n tiên quy t ñ th c hi n thành công bi n n p gen Xây d ng m t h th ng nuôi c y và tái sinh cây hoàn ch nh là ti n ñ quan tr ng cho các nghiên c... tri n mía ch y u các vùng có ñi u ki n t nhiên khó khăn không tư i (khô h n), cây thư ng b b nh (n m, virus, ñen ng n ) làm gi m giá tr Vì v y, nghiên c u chuy n gen mang ñ c tính có giá tr vào cây mía là m t hư ng ñi m i c n ñư c quan tâm Mía là cây tái sinh t t, ñây là ti n ñ quan tr ng cho vi c xây d ng h th ng tái sinh cây hoàn ch nh làm c s cho các nghiên c u ch n t o gi ng mía chuy n gen Tuy... li u kh i ñ u cho các nghiên c u v nhân gi ng, gây ñ t bi n [37], ch n t o gi ng, làm s ch virus [48] và b o qu n ngu n tài nguyên cây tr ng [50] Nh ng nghiên c u v ngu n v t li u ban ñ u cho tái sinh cây mía t nuôi c y in vitro c a các tác gi : Ho & Vasil (198 3) [40], Chen và c ng s (198 8) [26] cho r ng có th nhân nhanh cây mía b ng tái sinh tr c ti p t ch i nách Taylor (199 4) (199 7) ñã áp d ng k... a các ch t ñi u hòa sinh trư ng b sung vào môi trư ng MS nh m m c ñích tái sinh cây N ng ñ NAA cao ho c NAA k t h p v i IAA, IBA s kích thích quá trình t o r [21] Nghiên c u c a Alam và c ng s cho th y callus kh i t o trên môi trư ng MS b sung 2,4-D cho t l tái sinh ch i cao hơn callus kh i t o trên môi trư ng b sung NAA Và h u h t các nghiên c u ñ u cho th y ch i mía ñư c tái sinh v i t l cao trên... m chuy n gen vào t bào tr n c a mía s d ng kĩ thu t PEG (polyethylene glycol) Các t bào tr n sau khi chuy n gen (t n s 8/10 7) ñã mang plasmid pABD1 và hình thành các c m t bào kháng kanamycin Tuy nhiên, trong nghiên c u này, h ñã không thu ñư c callus và cây chuy n gen tái sinh [26] Nghiên c u ñ u tiên v cây mía chuy n gen thành công ñư c Bower & Bich báo cáo vào năm 1992 s d ng súng b n gen [23] Năm... tr ng tr t Tuy nhiên, công tác ch n t o gi ng mía m i, ñ c bi t ch n t o gi ng mía nh phương pháp bi n n p di truy n còn h t s c m i m và chưa ñư c quan tâm nghiên c u Do ñó, ñ t o ti n ñ cho nh ng thành công ti p theo trong các nghiên c u v cây mía, vi c xây d ng m t h th ng tái sinh hoàn ch nh t o ngu n v t li u kh i ñ u cho các nghiên c u chuy n gen cây mía Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n . CẦU CỦA ðỀ TÀI 1.2.1 Mục ñích Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây mía (Saccharum ssp. ) phục vụ cho tạo giống mía chuyển gen- làm cơ sở cho chọn tạo giống mía năng suất cao, chất lượng. liệu khoa học về vấn ñề hệ thống tái sinh và chuyển gen cây mía 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen tạo cơ sở cho việc chuyển các gen mang các ñặc tính. GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  BÙI NGỌC TRANG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH PHỤC VỤ CHO TẠO GIỐNG MÍA (SACCHARUM SSP. ) CHUYỂN GEN LUẬN