B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I  LÊ LAN HƯƠNG NGHIÊN C U T O CH PH M BÀO T BACILLUS SUBTILIS B T HO T H P PH KHÁNG NGUYÊN CÚM A/H5N1 VÀ ðÁNH GIÁ KH NĂNG SINH ðÁP NG MI N D CH TRÊN CHU T CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGH SINH H C Mà S : 60.42.02.01 GI NG VIÊN HƯ NG D N KHOA H C PGS.TS ðINH DUY KHÁNG GS.TS NGUY N QUANG TH CH HÀ N I - 2013 L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan s li u k t qu nghiên c u khóa lu n hồn tồn trung th c chưa đư c s d ng ñ b o v m t h c v Tác gi lu n văn Lê Lan Hương Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii L I C M ƠN ð hoàn thành lu n văn t t nghi p này, tơi nh n đư c s hư ng d n, giúp đ góp ý nhi t tình c a tồn th cán b nghiên c u c a phòng Vi sinh v t h c phân t - Vi n Công ngh sinh h c, tr c thu c Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam Và s hư ng d n, góp ý c a quý th y tồn th cán b B mơn Cơng ngh sinh h c th c v t – Khoa Công ngh Sinh h c – Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i Trư c h t, tơi xin chân thành c m ơn đ n quý th y cô Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i, đ c bi t nh ng th y t n tình d y b o cho su t th i gian h c t p t i trư ng Tôi xin g i l i c m ơn chân thành t i GS TS Nguy n Quang Th ch ñã truy n ñ t nh ng ki n th c m i giúp đ tơi q trình hồn thành lu n văn Tôi xin g i l i bi t ơn chân thành sâu s c nh t ñ n PGS.TS ðinh Duy Kháng ñã dành r t nhi u th i gian tâm huy t hư ng d n nghiên c u đ tơi hồn thành khóa lu n, mà t t c truy n đ t cho tơi kinh nghi m làm vi c tư nghiên c u khoa h c Tơi xin chân thành c m ơn gia đình b n bè ñã t o r t nhi u u ki n, giúp đ tơi h c t p hoàn thành t t lu n văn Hà N i, ngày 12 tháng 09 năm 2013 H c viên Lê Lan Hương iii M CL C L i cam ñoan ii L i c m ơn iii M cl c iv Danh m c ch vi t t t vii Danh m c b ng viii Danh m c hình ix M ð U Chương T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Di n bi n d ch cúm gia c m A/H5N1 1.1.1 Tình hình d ch cúm gia c m A/H5N1 th gi i 1.1.2 Tình hình d ch cúm gia c m A/H5N1 t i Vi t Nam 1.2 ð c ñi m virus cúm A/H5N1 11 1.2.1 Phân lo i c u trúc di truy n virus cúm A/H5N1 11 1.2.2 Sinh b nh h c tri u ch ng lâm sàng c a b nh cúm 13 1.2.3 Các phân ño n mã hóa kháng nguyên b m t ch y u 15 1.3 Phương pháp ch n đốn d phịng 16 1.3.1 Phân l p đ nh lo i virus 16 1.3.2 Phát hi n v t li u di truy n c a virus 17 1.3.3 Các k thu t mi n d ch s d ng ch n đốn huy t h c nghiên c u cúm 17 1.3.4 Vaccine phòng cúm A/H5N1 19 1.3.5 Ch t b tr dùng vaccine cúm A/H5N1 21 Chương V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 24 2.1 V t li u nghiên c u 24 2.1.1 Sinh ph m nghiên c u 24 2.1.2 Các dung d ch, hoá ch t, môi trư ng dùng nghiên c u 24 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv 2.1.3 Các trang thi t b d ng c dùng cho nghiên c u 25 2.2 Phương pháp nghiên c u 27 2.2.1 p tr ng 27 2.2.2 Soi tr ng 27 2.2.3 Tiêm tr ng 27 2.2.4 Thu ho ch tr ng 28 2.2.5 Ph n ng ngưng k t h ng c u (ki m tra hi u giá HA) 29 2.2.6 Phương pháp s n xu t kháng nguyên virus tinh ch 30 2.2.7 Phương pháp ñi n di protein 31 2.2.8 ð nh lư ng HA b ng phương pháp khu ch tán mi n d ch (SRD) 32 2.2.9 Phương pháp ELISA 33 2.2.10 Phương pháp phân tích kh h p ph h t virus b t ho t bào t B.subtilis 34 2.2.11 Phương pháp chu n b ch ph m bào t B.subtilis PY79 h p ph h t virus cúm NIBRG-14 tinh ch b t ho t 35 2.2.12 Gây mi n d ch chu t thí nghi m thu m u đ phân tích đáp 35 ng mi n d ch Chương K T QU VÀ TH O LU N 36 3.1 K t qu s n xu t kháng nguyên tinh ch 36 3.1.1 K t qu ph n ng ngưng k t h ng c u c a d ch ni u nhi m cúm H5N1 ch ng NIBRG-14 ñ s n xu t kháng nguyên tinh ch 3.1.2 36 K t qu tinh ch kháng nguyên HA b ng li tâm siêu t c gradient saccaroza 37 3.1.3 K t qu th m tích 38 3.1.4 K t qu ñi n di SDS-PAGE ki m tra protein virus cúm NIBRG14 sau tinh ch 3.1.5 39 K t qu ñ nh lư ng b ng phương pháp Bradford 40 v 3.1.6 K t qu ñ nh lư ng kháng nguyên HA b ng phương pháp khu ch 43 tán mi n d ch gel th ch (SRD) 3.2 K t qu s n xu t ch ph m bào t Bacillus subtilis PY79 h p ph h t virus tinh ch 44 3.2.1 K t qu h p ph virus lên bào t 44 3.2.2 K t qu t o ñáp ng kháng th chu t gây mi n d ch b ng ch ph m bào t B.subtilis PY79 b t ho t h p ph virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tinh ch 46 K T LU N VÀ KI N NGH 49 K t lu n 49 Ki n ngh 49 TÀI LI U THAM KH O 50 PH L C 57 CƠNG TRÌNH ðà CƠNG B LIÊN QUAN ð N LU N VĂN 61 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C CÁC CH VI T T T BSA: Albumin from Bovine Serum (Albumin t huy t bê) CDC: Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Ki m soát Ngăn ng a d ch b nh) FAO: Food and Agriculture Organisation of United Nations (T ch c lương th c nông nghi p c a Liên hi p qu c) HPAI: Highly pathogenic avian influenza (Cúm gia c m ñ c l c cao) IVI: International Vaccine Institute (Vi n Vaccine Qu c t ) MDCK: Madin – Darby Canine Kidney (T bào th n chó Madin – Darby) NIBSC: The National Institute for Biological Standards and Control (Vi n Qu c gia v Tiêu chu n Ki m ñ nh Sinh h c) OIE: World Organisation for Animal Health (T ch c Thú y Th gi i) PBS: Phosphate Buffered Saline (Mu i ñ m phosphate) 10 WHO: World Health Organization (T ch c Y t Th gi i) vii DANH M C B NG STT 1.1 Tên b ng Trang Th ng kê s ngư i b nhi m cúm gia c m H5N1 th gi i ñư c báo cáo cho T ch c Y t Th gi i năm 2003-2013 1.2 T ng h p tình hình b nh cúm gia c m năm (2008-2012) 2.1 Thành ph n gel polyacrylamit 31 3.1 Giá tr OD595nm c a ñư ng chu n BSA m u virus 41 3.2 K t qu ñáp ng kháng th HI c a nhóm chu t ñư c gây mi n d ch v i công th c khác Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 48 viii DANH M C HÌNH STT Tên hình 1.1 So sánh di n d ch cúm qua năm 1.2 S lư ng Trang 10 d ch xu t hi n trung bình năm chia theo tháng 10 1.3 So sánh m c ñ d ch cúm qua năm 11 1.4 C u trúc h t virion hình thái c a virus cúm A 13 3.1 K t qu ph n ng ngưng k t h ng c u c a d ch ni u 36 3.2 Hai d i băng virus xu t hi n sau li tâm phân vùng 37 3.3 K t qu ñi n di ki m tra protein c a virus NIBRG-14 sau tinh ch 39 3.4 ð th bi u di n ñư ng chu n tương quan gi a giá tr OD595nm n ng ñ BSA 42 3.5 K thu t SRD ñ nh lư ng kháng nguyên HA 43 3.6 K t qu h p ph h t virus cúm A/H5N1 (NIBRG-14) tinh ch lên bào t B subtilis PY79 b t ho t 3.7 45 K t qu ñáp ng kháng th c a chu t gây mi n d ch v i kháng nguyên cúm NIBRG-14 47 ix PH L C 3.1.2 Các dung d ch, hố ch t, mơi trư ng dùng nghiên c u - Dung d ch PBS 0,01M: NaCl 8,015g Na2HPO4.7 H2O 2,6807g KH2PO4 0,408g Nư c c t l n lít pH= 7,2; kh trùng 0,8 atm, 15 phút - Chloramin 1% - C n I t % - Ch t hi n màu TMB (3,3,5,5, Tetramethyl Benzidine) - Dung d ch nư c mu i sinh lý 0,9% NaCl 9g Nư c c t l n 1000 ml - Dung d ch Alserver Destroza 10,250 g Nacitrat 4,00 g Acit citric 0,275 g NaCl 2,100 g Nư c c t l n 500 ml pH = – 6,2 - Dung d ch dùng cho ñi n di protein : + Dung d ch ñ m SDS- PAGE 10X Tris bazơ 15,14g Glicin 72,1g 57 Khu y tan r i b sung 25 ml SDS 20% Sau b sung nư c kh ion v a ñ 500ml + Dung d ch ñ m tra m u (SDS-PAGE sample) 2X Tris- HCl 0,5M pH6,8 1ml Glicerol 0,8ml SDS 20% 0,8ml 2- Mercaptoethanol 0,4ml Bromphenol Blue 1% 0,2ml Nư c kh ion v a ñ 4ml + Dung d ch acrylamit- bisacrylamit 30% Acrylamit bazơ 29g Bisacrylamit 1g Nư c kh ion 100ml + Dung d ch t y màu Methanol 450ml Axit acetic 100ml Nư c kh ion 450ml - Dung d ch Thimerosal 1/100 - Dung d ch formandehide 37% - Dung d ch NaHSO3 8,8% - C n 700 - Dung d ch Sacaroza 15%, 30% 60% PBS 0,01 M pH 7,0-7,2 - Dung d ch 20 µM succinimidyl tetramethyl rhodamine (TMR, Invitrogen) - Dung d ch 20 µM succinimidyl fluorescein isothiocyanate (FITC, Invitrogen) - Dung d ch dùng cho ELISA: Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 58 Dung d ch g n b n pH=9,6: NaHCO3 0,703g NaN3 0.050g Nư c c t l n 150ml Sau hoà tan, dùng dung d ch Na2CO31%, ch nh pH t i 9,6, sau ñó b sung nư c c t t i 250 ml ð t l nh 40C dùng tu n Dung d ch PBS 1X, pH= 7,3 NaCl 16g KCl 0,4g Na2HPO4 7H2O 2,3g KH2PO4 0,4g Nư c c t l n lít Dung d ch r a b n pH= 7,2- 7,5 PBS 2000ml Tween 20 2ml Dung d ch ph b n 1g s a b t pha 100ml dung d ch r a b n - Các mơi trư ng dùng đ ki m tra vô trùng: + Môi trư ng th vi n m ( môi trư ng canh thang Sabourau) Agabacter 0,5 g/l Peptin 5g Nư c th t bò 5g Glucose 20 g Natriumthioglycolat 2g + Môi trư ng th vi khu n hi u khí Luria Bertari medium (môi trư ng LB): Yeast extract 1g/100ml (1%) Trypton 1g/100ml (1%) NaCl 1g/100ml (1%) 59 Trung hòa b ng NaOH ñ n pH = 7,4 + Môi trư ng th vi khu n k khí (100 ml) Pepton 0,4 g Glucose 1g MgSO4 0,1 g Na2SO4 0,75 g NaCl 0,1 g Agabacter 1,5 g pH = + Môi trư ng nuôi c y Bacillus subtilis Thành ph n môi trư ng (g/l): Glucose: g; sodium citrate 3H20: 0,5 g; NH4CI: 0,5 g; tryptophan: 0,02 g; KH2PO4: 1,36 g; Na2SO4: 0,142 g; NaNO3: 0,085 g; KCI: 0,075 g; MgCl2-6H20: 0,0246 g; FeCI3-6H20: 1,08 mg; MnCl2-4H20: 0,079 g; CaCl2-6H20: 0,219 g Ch nh pH v 7,1 v i NaOH ð i v i môi trư ng th ch, c n b sung % agar Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 60 CƠNG TRÌNH ðà CƠNG B LIÊN QUAN ð N LU N VĂN CƠNG TRÌNH CƠNG B CĨ LIÊN QUAN ð N LU N VĂN 61 ... m: Bangladesh (3 ca), Cambodia (3 ca), Trung Qu c (2 ca), Ai C p (11 ca), Indonesia (9 ca) Vi t Nam (4 ca) Trong tháng ñ u năm 2013, s ngư i b nhi m cúm H5N1 có: Bangladesh (1 ca), Cambodia (11... pathogenic avian influenza (Cúm gia c m ñ c l c cao) IVI: International Vaccine Institute (Vi n Vaccine Qu c t ) MDCK: Madin – Darby Canine Kidney (T bào th n chó Madin – Darby) NIBSC: The National... gi a HA1 HA2 g m m t s amino acid mang tính ki m ðây m c t c a protein HA (HA cleavage site) dư i tác d ng c a enzyme protease trình t amino acid t i vùng có vai trị quy t đ nh đ c l c c a virus