ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT 1.1 Định nghĩa 1.2 Nguyên tắc 1.3 Quy trình thực hiện 1.3.1 Chuẩn bị mẫu 1.3.2 Chạy điện di một chiều với SDS-PAGE 1.3.3 Chuyển protein từ gel lên màng 1.3.4 Lai với antibody 1.3.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh 1.4 Ưu, nhược điểm 1.4.1 Ưu điểm 1.4.2 Nhược điểm 1.5 So sánh với phương pháp ELISA 1.6 ứng dụng CHƯƠNG 2. ỨNG DỤNG 2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giởi và ở Việt Nam 2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 2.2 Giới thiệu hội chứng Taura- TS 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của Taura-TS 2.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm 2.3 Các phương phápvà kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura 2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng 2.3.2 Phương pháp miễn dịch 2.3.3 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gene 2.4 Vật liệu và phương pháp GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 1 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH 2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm màu gel 2.4.2 Các dung dịch để thực hiện western Blot 2.4.3 Vật liệu 2.4.3.1 Kháng thể 2.4.3.2 mẫu 2.4.4 Phương pháp 2.5 Kết quả 2.6 Kết luận GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 2 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH MỞ ĐẦU Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt. Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, thì các kỹ thuật về sinh học phân tử ra đời: phương pháp western blot, PCR, Phương pháp western blot là một kỹ thuật quan trọng được sử dụng trong tế bào và sinh học phân tử. Bằng cách sử dụng western blot , các nhà nghiên cứu có thể xác định được protein cụ thể trong một hỗn hợp phức tạp có chứa các protein chiết xuất từ tế bào. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT 1.1 Định nghĩa Western blot( còn có tên gọi khác là Western blotting hay phương pháp lai thấm protein) là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecul sulfate- polyacrylamide gen eletratphoresis), thường thì sử dụng antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang để phát hiện một loại protein nào đó, được dùng rộng rải trong chuẩn đoán HIV, viêm gan,…. 1.2 Nguyên tắc Trong western blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS- polyacrylamide (SDS-PAGE), miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS)- là một tác nhân biến tính protein. Các vạch protein được chuyển lên màng nitrocellulose và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâm màng nitrocellulose với kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí của nó trên các điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X quang. Gọi là hình X quang. 1.3 Quy trình thực hiện GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 3 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH 1.3.1 Chuẩn bị mẫu -Mẫu được lấy từ mô thực vật, hoặc động vật bằng cách cắt ra thành nhiều mảnh nhỏ. -Cho thêm các chất tẩy rửa, muổi, dung dịch đệm khác nhau để ly giải tế bào và hòa tan protein. - Rửa sạch các tế bào trong bình nuôi cấy mô hoặc bằng cách thêm dung dịch đệm phosphate buffered saline (PBS) lạnh và lắc nhẹ nhàng. • Lysis buffer (dùng để chuẩn bị mẫu để chạy trên gel, các tế bào và mô cần phải được phân giải để giải phóng protein quan tâm) chứa: Sodium hydroxide(NaOH): phá vỡ thành tế bào. Sodium dodecyl sulfate(SDS): hòa tan màng tế bào. Tris, pH 7,5 GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 4 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH Nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base DNA, SDS cũng làm biến tính phần lớn các protein trong các tế bào. -Ngay sau khi ly giải xảy ra, dephosphoryl phân giải protein, và biến tính bắt đầu. Để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của tế bào ta thêm chất ức chế protease và phosphatase vào dung dịch đệm. -Chuẩn bị mẫu thường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh(C) để tránh làm biến tính protein và suy thoái. 1.3.2 Chạy điện di 1 chiều -Chọn một loại gel thích hợp để phát hiện các protein quan tâm. Phổ biến nhất của điện di gel sử dụng gel polyacrylamide và bộ đếm được nạp với SDS. Nồng độ của acrylamide trong thường được sử dụng gel thay đổi 7-15%. +SDS là một chất khử amionic gây biến tình protein bằng cách bao quanh bộ khung polypeptide khiến các phân tử duỗi thẳng ra. -Lắp ráp các thiết bị điện và thiết lập gel. -Lắp đầy cả thùng bên trong và bên ngoài của thiết bị điện với bộ đệm điện di và rửa sạch mỗi giếng của gel bằng cách ngâm nó nhiều lần với đệm điện. -Thêm SDS mẫu đệm và điều chỉnh nhiệt độ của mẫu ở 95 ° C trong vòng 3 phút hoặc ở 75 ° C trong 10 phút để làm biến tính protein. - Đưa mẫu và đánh dấu vào các giếng của gel SDS-PAGE. + Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. + Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của protein ban đầu; vì thế điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Sau đó các mẫu được nạp vào giếng trong gel. - Chạy các mẫu tại một điện thế không đổi (200 V). Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như bromophenol blue. GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 5 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH - Tháo rời bộ máy điện và đưa gel ra. + Độ phân giải của SDS-Page là rất lớn. các phức hợp được tách thành hàng trăm vết băng trên gel. 1.3.3 Chuyển protein từ gel đến màng -Mục đích của phương pháp này là để kéo protein từ gel vào PVDF hoặc màng nitrocellulose Nguyên tắc: - Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các protein được chuyển từ trong gel lên màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride( PVDF). Ta chọn màng nitrocellulose. - Cắt kính thước màng tế bào vào giấy lọc cho cùng kích thướt với gel + Xử lý các gel nhẹ nhàng trong đệm SDS. Không ngâm gel trong bộ đệm khác như PBS, bởi vì để giữ cho protein điện tích âm. - Ngâm màng, giấy lọc, và miếng thấm trong bộ đệm western transfer buffer. GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 6 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH - Khi lắp ráp các lớp thấm để thực hiện việc chuyển protein, tránh có không khí hoặc bong bóng ở giữa màng và gel, ta giữ màng và gel ướt cho đến khi phân tích western blot hoàn thành. - Thực hiện chuyển protein trên màng trong khoảng 30 phút với cường độ 20mA/cm. + Trong thực tế, phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì chúng mất nhiều thời gian; electrblotting được ưa thích hơn. Kết quả của hai quá trình “ thấm” các protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để phát hiện. Cả hai mạng tế bào được lựa chọn cho các thuộc tính cụ thể không protein ràng buộc( tức là liên kết tất cả các protein tốt như nhau). +Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương tác giữa các màng tế bào và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn so với PVDF, nhưng mỏng manh hơn và không đứng lên cùng probing lặp đi lặp lại. +Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có thể được kiểm tra bằng cách nhuộn màng với coomasise Brilliant blue hoặc S thuốc nhuộm ponceau. Ponceau S phổ biến hơn do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan nước, sau này làm cho nó dể dàng hơn để sau đó destain và thăm dò màng 1.3.4 Lai với antibody - Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel. Rửa màng lai 5-10 phút trong dung dịch TTBS. TTBS là hỗn hợp của Tris-buffered saline và Tween 20 0.05%  Nếu trong TTBS mà không cho Tween thì kháng thể nó bám không đặc hiệu mạnh hơn.  Nếu không có Tween để pha đệm rửa thì có thể thay bằng Triton X-100 - Ủ trong dung dịch khóa - Sau đó rửa màng lai 2 lần với TBS, 5-10 phút mỗi lần rửa. TBS (Tris-buffered saline) là dung dịch đệm dùng để rửa sạch màng nitrocellulose và duy trì độ pH trong phạm vi tương đối hẹp. Gồm: 50 mM Tris 150 mM NaCl GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 7 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH - Ủ màng lai đã cố định protein trong 1- 2 giờ với một kháng thể sơ cấp( primary antibody) với sự kích động nhẹ. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm. - Rửa màng lai 2- 6 lần với TTBS , 5-10 phút mỗi lần rửa. - Ủ màng lai lai với một kháng thể thứ cấp( secondary antibody) có enzyme ( alkalin phosphattase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong 1 giờ có kích động nhẹ. - Sau đó rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10 phút cho mỗi lần rửa. - Rửa màng lai lần cuối với TBS. - Tiếp tục ủ mạng lai trong 1 hỗn hợp đặc hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức protein- kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp-enzyme hay ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm. -Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme. 1.3.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh.  Phát hiện bằng đo màu Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền có khả năng phản ứng với các enzyme( như pexodase) được ràng buộc với các kháng thể thứ cấp. Phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng không hòa tan của một màu sắc khác nhau tủa thành các vết ngay bên cạnh các enzyme và qua xuất hiện vết tren màng. Phản ứng phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những thuốc nhuộm hòa tan. Hàm lượng protein được đánh giá thông qua densitometry ( cường độ vết là) hoặc quang phổ.  Phát hiện bằng huỳnh quang Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bới ánh sáng và sự phát xạ kích thích sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh kỹ thuật số và cho phép phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử, số lượng phân tử. Huỳnh GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 8 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH quang được coi là phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít nhạy cảm hơn Chemiluminescent.  Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền sẽ làm cho luminese tiếp xúc với reporter trên kháng thế sơ cấp. Ánh sang sau đó được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp một ảnh kỹ thuật số. Những hình ảnh được phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học. Mới hơn phần mền cho phếp phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp được sử dụng. 1.4 So sánh với phương pháp ELISA 2.2.1 Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay) Còn được gọi là EIA( enzyme immuno assay) Nguyên tắc: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể được gắn với một enzym bằng liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất(introphenol phosphate) làm thay đổi màu do hoạt tính của enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên. Quy trình: GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 9 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies,… Kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, được thực hiện qua hai bước: • Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. • Phản ứng hóa học: thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H 2 O 2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. Kỹ thuật này khá nhạy cảm và đơn giản, cho phép xác định được kháng nguyên hay kháng thể ở một nồng độ rất thấp. 2.2.2 So sánh: Phương pháp Western Blot ELISA Phát hiện màu Mẫu dò -Trích từ protein của tế bào. -Phức hợp protein-kháng nguyên sơ cấp-kháng nguyên thứ cấp. - Gắn với enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ. -Chạy trên gel SDS-PAGE. -Tắc nghẽn với protein dư. -Kháng thể đối kháng với protein X được đánh dấu phóng xạ hay enzyme -Trích từ kháng nguyên. -Phức hợp giữa kháng nguyên-kháng thể. - Cho thêm chất tạo màu. -Chạy trên đĩa plastic. -Tắc nghẽn với kháng nguyên dư. -Kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên thông qua enzyme. 2.3 Ưu, nhược điểm 2.3.1 Ưu điểm - Cho kết quả nhanh. - Sinh phẩm dễ bảo quản. - Có thể làm số lượng hàng loạt hay ít mẫu. GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 10 [...]... phòng thí nghiệm hoặc từ những nguồn thương mại Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển 3.4 Vật liệu và phương pháp GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 13 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH Có nhiều phương pháp được sử dụng nhưng ở đây ta chỉ đi sâu vào phương pháp western blot 3.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm gel Dung... dịch gốc để thực hiện western blot Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS) 3.4.3 Vật liệu 3.4.3.1 Kháng thể Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât... 29, 28, 26, 22, 19 và 17 kD Sử dụng RTV ở tôm sú nhân qua tế bào làm kháng nguyên để thu kháng thể đặc hiệu dùng cho phương pháp Western Blot (Hình 4.2) Kết quả thu được các protein đặc trưng rất tách biệt ở mẫu RTV từ tôm TCT (RTV-PvM) Kết quả trên cho thấy kháng thể GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 19 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH đặc hiệu RTV từ tôm sú đã nhận biết RTV từ tôm TCT Như... ra khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting • • • 3.4.4.2 Phương pháp Western Blot GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 15 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH Sau khi thực hiện chuyển protein lên gel SDS ta thực hiện phản ứng gắn proteinkháng thể bằng phương pháp western blot với những bước như sau: Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel Ngâm running gel trong Towbin transfer buffer... http://vbs.ac.vn/bai-tong-quan /western- blotting-n172/ [4] http://vbs.ac.vn/bai-tong-quan/ky-thuat-elisa-n211/ [5] http://www.vbs.ac.vn/print.php?post=172 [6] http://www.slideshare.net/nguyenhang8966 /western- blot1 [7] http://www.scbt.com/protocol _western_ immuno_blotting.html [8] http://en.wikipedia.org/wiki /Western_ blot [9] http://www.piercenet.com/method/overview-westernblotting#electrophoreticseparationofproteins... lên trong tế bào côn trùng Sf9 Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9 • 3.4.4 Phương pháp 3.4.4.1 Phương pháp SDS-PAGE SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) là phương pháp điện di protein đứng, để phân tách được các thành phần protein theo trong lượng phân tử Chuẩn bị mẫu để điện di: Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới • Trong một tube Eppendorf,... trồng chuyển đổi gen - Đánh giá tính chuyên biệt của antibody - Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra - Phân tích sự phát triển của thực vật Trong y tế western blot được ứng dụng để: - Xác định bệnh nhân có kháng thể chống HIV trong mẫu huyết thanh không - Western blot sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêm gan B 2.3.2 CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ỨNG DỤNG CỦA WESTERN BLOT TRONG NGHIÊN CỨU ĐẶC... chuyển thấm qua màng nitrocellulose Blocking bằng TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk ủ kháng nguyên mục tiêu trên màng với kháng thể sơ cấp rửa ủ với kháng thể thứ cấp có gắn enzyme peroxidase rửa hiện màu chụp hình 3.5 Kết quả GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 17 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range Giếng 2, 3: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú...ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH - Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, không cần máy móc, dụng cụ đắt tiền - Độ đặc hiệu cao Đọc kết quả bằng mắt thường - Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở Nhược điểm - Chỉ xác định được sự có mặt của protein hiện diện nhưng không xác định được số lượng cụ thể - Chi phí giá thành cao do western blot chỉ có thể thực hiện với điều kiện các kháng thể kháng... kháng lại protein quan tâm là có sẵn - Phương pháp phức tạp cần đòi hỏi nguồn nhân lực có kinh nghiệm và được đào tạo kỹ lưỡng - Tốn nhiều thời gian thí nghiệm như trong bước điện di 2.4 Ứng dụng Phương pháp western blot được ứng dụng để: - Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô - Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu - Đánh giá độ lớn của gen mục tiêu - Định