BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC TRỊNH THỊ THƢƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO GIỐNG SẮN KM 94 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Sơn La, năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC TRỊNH THỊ THƢƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO GIỐNG SẮN KM 94 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Sinh lý thực vật KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Đỗ Hải Lan Sơn La, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Đỗ Hải Lan người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và truyền thụ những kiến thức, kinh nghiệm cho em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Hóa , các thầy, cô giáo phòng thực hành Di truyền – Thực vật đã tạo điều kiện cho chúng em về cơ sở vật chất, trang thiết bị. Em xin chân thành cảm ơn Phòng KHCN – HTQT - Trường Đại học Tây Bắc đã giúp đỡ, ủng hộ nhiệt tình cho tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới tất cả những người thân trong gia đình cùng toàn thể bạn bè đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Sơn La, tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Trịnh Thị Thƣơng KÝ HIỆU VIẾT TẮT AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) A. tumefaciens: Agrobacterium tumefaciens BAP : 6-benzylaminopurin CIAT: Centro Internacional de Agricultura Tropical DNA : Deoxiribonucleic Acid FAO : Food and Agriculture Organization Gus : β-1,4-Glucuronidase MS : Murashige and Skoog, 1962 OD: Optical density Ti-plasmid : Tumor-Inclucing Plasmid T-DNA : Transfer-DNA Vir : Virulence VTM: Vitamin X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lí do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Đối tượng và thời gian nghiên cứu 2 4.1. Đối tượng nghiên cứu 2 4.2. Thời gian nghiên cứu 2 5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 2 5.1. Địa điểm 2 5.2. Phạm vi nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về cây sắn 3 1.1.1. Nguồn gốc 3 1.1.2. Vị trí phân loại 3 1.1.3. Tính đa dạng và phân bố 3 1.1.4. Giá trị của cây sắn 4 1.1.5. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam 5 1.1.5.1. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5 1.1.5.2. Tình hình sản xuất sắn ở Việt Nam 7 1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài nước 8 1.2.1. Trên thế giới 8 1.2.2. Ở Việt Nam 10 1.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 10 1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens 11 1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 12 1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN 13 1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 13 1.4. Gen chỉ thị chọn lọc 14 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHA ́ P NGHIÊN CỨU 16 2.1. Vật liệu 16 2.1.1. Vật liệu thực vật 16 2.1.2. Vi khuẩn 16 2.2. Hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy 16 2.2.1. Hóa chất 16 2.2.2. Thiết bị 16 2.2.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.2. Tạo vật liệu chuyển gen 17 2.3.3 Các bước chuyển gen 19 2.3.4. Phương pháp xác định hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm hóa tế bào 21 2.4. Xây dựng các công thức thí nghiệm 22 2.5. Xác định chỉ tiêu cho mỗi công thức 22 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 1. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá chưa trưởng thành của giống sắn KM 94 23 2. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào đoạn thân non của giống sắn KM 94 26 3. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá mầm của giống sắn KM94 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 1. Kết luận 34 2. Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog) 16 Bảng 2. Thành phần của môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 17 Bảng 3. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thànhgiống sắn KM 94 23 Bảng 4. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của mảnh lá chưa trưởng thành giống sắn KM 94 25 Bảng 5. Tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 27 Bảng 6. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của đoạn thân non giống sắn KM 94 28 Bảng 7. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 30 Bảng 8. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhộm Gus của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 31 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Ti-Plasmid 12 Hình 2. Mảnh lá chưa trưởng thành và đoạn thân đặt trên môi trường tạo mô sẹo 18 Hình 4. Mảnh lá non chưa trưởng thànhcủa giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 23 Hình 5. Mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thành có mặt gen Gus 25 Hình 6. Đoạn thân non giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 26 Hình 7. Mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 có mặt gen Gus 28 Hình 8. Mảnh lá mầm giống sắn KM 94 cảm ứng tạo mô sẹo 29 Hình 9. Mô sẹo mảnh lá mầm của giống sắn KM 94 có mặt gen Gus 31 1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt đới của Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latin, đáp ứng nhu cầu cho 500 triệu người. Củ có hàm lượng chất khô chiếm 20% trong đó 80% là tinh bột. Mục đích sử dụng sắn khác nhau ở các vùng, ở Châu Phi, sắn được sử dụng chủ yếu làm lương thực, trong khi đó ở Thái Lan, một nửa sản lượng 20 triệu tấn sắn hàng năm được sử dụng cho công nghiệp tinh bột. Với sự phát triển kinh tế, lượng tinh bột cần cho công nghiệp tăng lên ở các quốc gia đang phát triển. Mặc dù các nước nhiệt đới có nguồn tinh bột sắn (hoặc khoai tây, củ cải), nhưng vẫn phải nhập khẩu tinh bột ngô đắt đỏ. Để đủ lượng tinh bột sử dụng, tinh bột phải được biến đổi theo nhiều cách khác nhau. Nếu tinh bột sắn với những đặc tính mong muốn được tạo ra, đây sẽ là nguồn tinh bột cạnh tranh với các nguồn tinh bột khác, người nông dân có thể trồng sắn để tăng thu nhập [27]. Trên thực tế, lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân và sản xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng ưu tú có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp ứng giải quyết các vấn đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu sinh học, hàm lượng tinh bột được đánh giá cao hơn năng suất [24]. KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực ở Việt Nam do năng suất và hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống mới, được lựa chọn làm đối tượng chuyển gen. Trong đó gen chỉ thị Gus thường được sử dụng để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen trước khi tiến hành chuyển các gen đích mong muốn. Do vậy để tạo tiền đề cho những nghiên cứu tạo ra giống sắn mang gen đích mong muốn và đạt kết quả cao cần phải xây dựng một quy trình chuyển gen hoàn chỉnh. Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” 2 2. Mục tiêu đề tài Xây dựng được quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo nguyên liệu chuyển gen: nhân nhanh giống sắn KM 94. - Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A. Tumefaciens và nuôi cấy mẫu của giống sắn KM 94. - Kiểm tra và xác định hiệu quả chuyển gen. 4. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.2. Thời gian nghiên cứu Khóa luận được thực hiện từ tháng 9/2013 đến 5/2014, chia làm các giai đoạn: - Trong tháng 9/2013: Thu thập thông tin liên quan đến khóa luận. - Từ tháng 10/2013 – 4/2014: Tiến hành biến nạp gen Gus, nuôi cấy mẫu của giống sắn KM 94 và kiểm tra sự có mặt của gen Gus. - Tháng 5/2014: Viết và bảo vệ khóa luận. 5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 5.1. Địa điểm Phòng thực hành Thực vật – Di truyền – Phương pháp – Vi sinh, khoa Sinh Hóa, trường đại học Tây Bắc, thành phố Sơn La, tỉnh Sơn La. 5.2. Phạm vi nghiên cứu Sự có mặt của gen Gus ở giống sắn KM 94. [...]... lúa, bông, cà chua nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tuy nhiên, ở Vi t Nam chưa có một công trình chuyển gen thành công nào ở sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium được công bố mà chỉ có một công trình chuyển gen bằng phương pháp bắn gen được công bố như: + Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì bằng phương pháp bắn gen Trước khi tiến hành chuyển gen, cần nghiên cứu hệ... hydrocyanic lớn hơn 50mg/kg sắn tươi Sắn ngọt: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic ít hơn 50mg/kg sắn tươi [9] 1.1.3 Tính đa dạng và phân bố Trong chi Manihot có 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống sắn phổ biến ở Vi t Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 93726, KM 419, KM 325 Trong đề tài này chúng tôi chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94 *Đặc điểm giống sắn KM 94 KM 94 có tên gốc là KU50... dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A .tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp này được sử dụng trong khóa luận này để chuyển gen Gus vào cây sắn 10 1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A tumefaciens A .tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u... nông sắn, với vi c giới thiệu giống sắn mới KM 60, KM 94 vào sản xuất đã tạo ra bước đột phá trong nghề trồng sắn ở Vi t Nam cùng với vi c đưa 42 nhà máy chế biến tinh bột sắn vào hoạt động, đã đánh dấu sự chuyển dịch vị trí cây sắn từ cây lương thực thành cây trồng hàng hóa [9]  Sử dụng sắn làm thức ăn gia súc: Bên cạnh sử dụng lương thực và chế biến tinh bột phục vụ cho các ngành công nghiệp, sắn. .. công trình liên quan được công bố như: + Nghiên cứu khả năng tái sinh và tiếp nhận gen của một số giống sắn (Manihot esculenta Cantz) Vi t Nam + Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz) qua phôi soma từ đỉnh chồi 1.3 Vi khuẩn A .tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen ở thực vật Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng súng bắn gen, ... khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, virC, virD và virE không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virC Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình tự biên 25... Dựa vào các gen chọn lọc được thiết kế trong vector chuyển gen mà người ta sử dụng các kháng sinh phù hợp để thu được các tế bào, mẫu mang gen chuyển Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông qua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen 14 Gus hay gen uidA Gen Gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E coli và mã hóa cho enzyme β-glucuronidase Đây... 70% và quan sát trên kính lúp soi 21 nổi Biểu hiện hoạt động của gen Gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu xanh chàm đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen [10] 2.4 Xây dựng các công thức thí nghiệm Thí nghiệm 1: Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các loại vật liệu chuyển gen khi lây nhiễm với vi khuẩn A tumefaciens *Lây nhiễm ngay * Đặt vật liệu chuyển gen trên... nhiễm với vi khuẩn A tumefaciens bao gồm: thời gian nhiễm khuẩn, thời gian và điều kiện đồng nuôi cấy giữa vật liệu chuyển gen và vi khuẩn A tumefaciens Gây nhiễm mô vật liệu với vi khuẩn A tumefaciens ở các mật độ quang của dung dịch khuẩn (OD660nm) khác nhau: 0,2; 0,5; 0,8; trong thời gian: 30 phút Thí nghiệm 3: Nghiên cứu loại chất chọn lọc và nồng độ thích hợp đối với loại vật liệu chuyển gen Xác... triệu tấn sắn lát, sắn vi n Năm 2006, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,15 triệu tấn tinh bột, bột sắn và 3,40 triệu tấn sắn lát và sắn vi n Thái Lan chiếm trên 85% lượng xuất khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia và Vi t Nam Thị trường xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột và tinh bột sắn, 25% là sắn lát và sắn vi n . tài Xây dựng được quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo nguyên liệu chuyển gen: nhân nhanh giống sắn KM 94. . nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá chưa trưởng thành của giống sắn KM 94 23 2. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào đoạn thân non của giống sắn KM 94 26 3. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào. dựng một quy trình chuyển gen hoàn chỉnh. Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài Xây dựng quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens