ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THẾ ANH XÂY DỰNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TÓC VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ARTEMISININ Ở CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA. LINN) Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật Mã số: 6042302 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. TRẦN VĂN MINH 2. TS. NGUYỄN THỊ THANH TP. Hồ Chí Minh – 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ba, má – Người đã sinh thành, dạy dỗ, yêu thương, chăm sóc và lo lắng cho tôi; cùng mọi thành viên trong gia đình đã chia sẽ, động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống. Thầy PGS.TS. Trần Văn Minh, Cô TS. Nguyễn Thị Thanh đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến cố GS. TS. Mai Trần Ngọc Tiếng, PGS. TS. Bùi Trang Việt, PGS.TS. Võ Thị Bạch Mai, TS. Nguyễn Du Sanh. Các quý Thầy, Cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian học tại trường. Cảm ơn các quý thầy cô, các anh chị, các bạn, các em ở Bộ môn sinh lý thực vật - trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận văn tại Bộ môn. Cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh, Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này. Cảm ơn tập thể lớp cao học SLTVK17, cảm ơn các anh, chị, các bạn đã giúp đỡ tôi trong ba năm học vừa qua. Cảm ơn cô Bùi Thị Tường Thu, bạn Lê Thị Hiền, bạn Trần Trọng Tuấn, cùng các anh chị, các bạn Phòng Công nghệ phôi soma - Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này. Cảm ơn các đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẽ và động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong công việc và cuộc sống. Phạm Thế Anh i Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17 MỤC LỤC Mục lục i Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục biểu đồ viii Danh mục hình ix Danh mục ảnh x Lời mở đầu 1 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét 3 1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua 3 1.1.1.1. Hệ thống phân loại. 3 1.1.1.2. Đặc điểm phân bố 3 1.1.1.3. Đặc điểm sinh thái 4 1.1.1.3.1. Điều kiện sống 4 1.1.1.3.2. Vòng đời 4 1.1.1.4. Thành phần hóa học 5 1.1.2. Tổng quan về bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị 6 1.1.2.1. Sơ lược về bệnh sốt rét 6 1.1.2.2. Artemisinin công cụ chữa bệnh sốt rét hiện nay 7 1.2. Sinh tổng hợp artemisinin 8 1.3. Tổng quan về chuyển gen tạo rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp. 11 1.3.1. Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc 11 ii Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17 1.3.1.1. Giới thiệu 11 1.3.1.2. Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ 12 1.3.1.3. Dùng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen vào thực vật 17 1.3.2. Nuôi cấy rễ chuyển gen và ứng dụng trong công nghệ nghiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp 19 1.3.3. Các nguyên lý cơ bản nhằm làm gia tăng quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ chuyển gen 19 1.3.3.1. Chọn lọc dòng rễ có năng suất cao 20 1.3.3.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy 21 1.3.3.3. Elicitor 21 1.3.3.4. Nuôi cấy hai giai đoạn 22 1.3.3.5. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. 23 1.3.3.5.1. Khái niệm bioreactor 23 1.3.3.5.2. Khó khăn và thuận lợi của nuôi cấy bằng hệ thống bioreactor 24 1.3.3.5.3. Phân loại bioreactor 25 1.3.3.5.4. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. 26 1.4. Sắc ký lỏng cao áp HPLC 27 1.4.1. Nguyên tắc 27 1.4.2. Thiết bị 28 iii Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 29 2.1.1. Nguồn mẫu ban đầu 29 2.1.2. Môi trường nuôi cấy 29 2.1.3. Dụng cụ thiết bị 29 2.2. PHƯƠNG PHÁP 29 2.2.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 29 2.2.1.1. Gieo hạt in vitro 29 2.2.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 29 2.2.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 31 2.2.1.3.1. Tách chiết DNA thực vật 31 2.2.1.3.2. Tách chiết plasmid DNA của Agrobacterium rhizogenes ATCC 11325 31 2.2.1.3.3. Phân tích PCR kiểm tra quá trình chuyển gen 32 2.2.1.4. Phân tích CĐHSTTV của rễ chuyển gen bằng phương pháp sinh trắc nghiệm 33 2.2.1.5. Định tính artemisinin trong rễ tóc bằng phương pháp TLC 36 2.2.1.5.1. Nguyên tắc 36 2.2.1.5.2. Cách tiến hành 37 2.2.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng lắc 38 2.2.2.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng và tích lũy artemisinin của rễ tóc 39 2.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đạm nitrat đến khả năng tích tụ artemisinin 39 2.2.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH 4 + /NO 3 đến tích tụ artemisinin 40 iv Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17 2.2.2.4. Ảnh hưởng của photphat vô cơ đến khả năng tích tụ artemisinin 40 2.2.2.5. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tích tụ artemisinin 40 2.2.2.6. Ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng tích tụ artemisinin 41 2.2.2.7. Môi trường cải tiến 41 2.2.3. Nuôi cấy rễ tóc Thanh hao trong bioreactor ngập chìm tạm thời 41 2.2.3.1. Động thái tăng trưởng của rễ trong bioreactor ngập chìm tạm thời 42 2.2.3.2. Biến động pH của môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 42 2.2.3.3. Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 42 2.2.3.4. Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 42 2.2.3.5. Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 43 2.2.3.5.1. Chu kỳ ngập chìm trong nuôi cấy bioreactor 43 2.2.3.5.2. Ảnh hưởng của YE và chitosan đến sự tích tụ artemisinin 43 2.2.4. Định lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC với bộ phản ứng sau cột và đầu dò UV 43 2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu 43 2.2.4.2. Định lượng artemisinin 44 2.3. XỬ LÝ THỐNG KÊ 45 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 46 3.1.1. Gieo hạt in vitro 46 3.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 47 v Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17 3.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 50 3.1.4. Đo hoạt tính CĐHSTTV 52 3.1.5. Định tính artemisinin 54 3.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng 55 3.3. Nuôi cấy rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 71 4.2. ĐỀ NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC vi Danh mục viết tắt Phạm Thế Anh SLTVK17 DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid BA : 6-benzyladenine B5 : Môi trường Gamborg và Eveleigh (1968) CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật GA 3 : Gibberellic acid HPLC : High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) LB : Môi trường Luria Bertani LV : Môi trường Litvay (1985) NAA : a-naphthaleneacetic acid MJ : Methyl Jasmonate MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962) PCR : Polymerase Chain Reaction SA : Acid Salisilic TLC : Thin layer chromatography (Sắc ký bản mỏng) YE : Yeast extract (Dịch chiết nấm men) ZEA : Zeatin WHO : World Health Organization viii Danh mục biểu đồ Phạm Thế Anh SLTVK17 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46 Biểu đồ 3.2. Hoạt tính Auxin, ABA, Cytokinin và Giberelin tổng ở rễ đối chứng và rễ tóc chuyển gen 52 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của môi trường đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 56 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đạm nitrate đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 57 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH 4 + /NO 3 đến khả năng tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 58 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của photphat đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 59 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của BA đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 60 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của GA 3 đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 61 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 62 Biểu đồ 3.10. Động thái tăng trưởng của rễ tóc nuôi trong bioreactor ngập chìm tạm thời 63 Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 65 Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 66 Biểu đồ 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 67 Biểu đồ 3.14. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 68 Biểu đồ 3.15. Ảnh hưởng của chu kỳ ngập chìm đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong bioreactor) 69 Biểu đồ 3.16. Ảnh hưởng của YE và Chitosan đến tích tụ artemisinin 71 vii Danh mục bảng Phạm Thế Anh SLTVK17 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 32 Bảng 2.2. Bảng bố trí các loại môi trường nuôi cấy thí nghiệm 38 Bảng 2.3. Bảng bố trí các hàm lượng đạm nitrat nuôi cấy thí nghiệm 39 Bảng 2.4. Bảng bố trí các tỷ lệ NH 4 + /NO 3 nuôi cấy thí nghiệm 39 Bảng 2.5. Bảng bố trí các hàm lượng KH 2 PO 4 nuôi cấy thí nghiệm 40 Bảng 2.6. Bảng bố trí các hàm lượng BA nuôi cấy thí nghiệm 40 Bảng 2.7. Bảng bố trí các hàm lượng GA 3 nuôi cấy thí nghiệm 41 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46 Bảng 3.2. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tổng cộng ở rễ tóc chuyển gen và rễ đối chứng 52 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng đến tích tụ artemisinin 55 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đạm nitrat đến tích tụ artemisinin 56 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH 4 + /NO 3 đến tích tụ artemisinin 57 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của photphat đến tích tụ artemisinin 58 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA đến tích tụ artemisinin 59 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của GA 3 đến tích tụ artemisinin 60 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin 61 Bảng 3.10. Động thái sinh trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62 Bảng 3.11. Biến động của pH môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 64 Bảng 3.12. Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 65 Bảng 3.13. Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 66 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 67 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của chu kỳ ngập chìm đến tích tụ artemisinin 68 Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của YE và Chitosan đến khả năng tích tụ artemisinin trong bioreactor 70 [...]... anua sản xuất artemisinin và gia tăng sinh khối hơn không chuyển gen nhiều, điều này đã làm cho chúng trở thành một hệ thống tốt để ngiên cứu sản xuất các hợp chất thứ cấp Phạm Thế Anh SLTVK17 2 Lời mở dầu Nhằm mục tiêu giải quyết phần nào tình trạng thiếu thuốc chữa trị sốt rét hiện nay,chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Xây dựng hệ thống nuôi cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin. .. cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh hao (Artemisia annua Linn) Đề tài gồm những nội dung chính sau: ü Thiết lập qui trình chuyển gen tạo rễ tóc ở cây Thanh hao ü Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng ü Nuôi cấy rễ tóc trên bioreactor ngập chìm tạm thời ü Tách chiết hợp chất thứ cấp và sử dụng phương pháp TLC và HPLC để định tính và định lượng hàm lượng artemisinin trong rễ tóc Đề tài này được thực... và nuôi cấy rễ chuyển gen Nuôi cấy rễ tóc chuyển gen là một hướng mới trong hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật, chúng thể hiện nhiều ứng dụng hứa hẹn trong tương lai hơn phương pháp nuôi cây tế bào và mô sẹo truyền thống Điều này được thể hiện qua tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng tổng hợp các chất thứ cấp và có tính bền vững cao về mặt di truyền và sinh hoá Agrobacterium chuyển gen tạo rễ tóc ở. .. hoàn toàn ngược lại khi bổ sung ở ngày thứ 12 Kết hợp sử dụng hai giai đoạn nuôi cấy có bổ sung CĐHSTTV cho phép tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy để sản xuất hợp chất thứ cấp 1.3.3.5 Ứng dụng bioractor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ 1.3.3.5.1 Khái niệm bioreactor Từ điển Oxford (2001) định nghĩa: Bioreactor là hệ thống trong đó có những phản ứng sinh học xảy ra, thông thường... được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, hoàn toàn không phụ thuộc vào yếu tố khí hậu và địa lý, đòi hỏi có nhiều điều chỉnh trong quá trình nuôi cấy cho sản xuất các hợp chất biến dưỡng quan trọng Kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi và đạt được nhiều thành tựu Khai thác rễ tóc chuyển gen (còn gọi lông rễ, giống với bệnh ra rễ ở thực vật trong tự nhiên do vi khuẩn gây ra, nguyên nhân của sự sản xuất. .. nhiên của Thanh hao hoa vàng ở miền Bắc Việt Nam bị ảnh hưởng nhiều bởi gió mùa đông bắc từ cuối thu đến xuân Ø Ánh sáng: Thanh hao hoa vàng là loại cây ưa sáng và ẩm Trong tự nhiên, có thể thấy cây hơi chịu bóng khi mọc lẫn với một số cây cỏ và cây bụi ở vùng đồi và chân núi đá vôi Theo “Trung dược thông báo” tập 11, số 7, 1986 chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng artemisinin trong lá;... tiềm năng sinh tổng hợp của lông rễ đã được theo dõi thông qua một số ít các nhà nghiên cứu, điển hình là sự sản xuất các alkaloid (Mano và cs., 1986; Payne và cs., 1987) Trong suốt những năm 1990, những nghiên cứu về vấn đề này gia tăng đáng kể, và hơn 400 bài báo về rễ tóc chuyển gen đã được công bố Các nghiên cứu đã nêu rõ một số thuận lợi trong việc nuôi cấy rễ tóc chuyển gen, bao gồm mối liên... trình sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ chuyển gen Trong suốt thập kỷ vừa qua, những tiến bộ đáng kể trong việc kích thích sự hình thành và tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tóc Các nhân tố ảnh hưởng đến sự gia tăng hoặc làm giảm hoạt tính sinh tổng hợp của nuôi cấy rễ tóc đều được quan tâm để cố gắng hiểu về sự đa dạng, cũng như để có được hàm lượng cao các hợp chất thứ cấp Ở thực... thứ cấp bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, như nguồn dinh dưỡng, các nhân tố gây stress, ánh sáng và chất điều hoà tăng trưởng thực vật (Giri và Lakshmi, 2000) Vì vậy, rõ ràng rằng sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng rễ tóc bị chi phối bởi điều kiện nuôi cấy (Kim và cs., 2002) Ở đây, một số nghiên cứu được tiến hành nhằm gia tăng hàm lượng của các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ Phạm Thế Anh... tạo rễ và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp 1.3.1 Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc 1.3.1.1 Giới thiệu Từ ngàn xưa, loài người đã phụ thuộc rất nhiều vào thực vật như nguồn cung cấp các protein, carbohydrat và chất béo (Rao và Ravishankar, 2002) Ngày nay số lượng và chủng loại các hóa chất do thực vật sản xuất (sử dụng trong dược phẩm, thực phẩm, phụ gia, mỹ phẩm và thuốc . NHIÊN PHẠM THẾ ANH XÂY DỰNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TÓC VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ARTEMISININ Ở CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA. LINN) Chuyên ngành: Sinh lý. rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh hao (Artemisia annua. Linn) Đề tài gồm những nội dung chính sau: ü Thiết lập qui trình chuyển gen tạo rễ tóc ở cây Thanh. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét 1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua 1.1.1.1. Hệ thống phân loại Theo Mabberley (1997), hệ thống phân loại của cây Thanh hao như sau: