ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN –R— PHẠM THANH DUY ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA (MULTIPLEX LIGATION DEPENDENT PROBES AMPLIFICATION) TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU HAPLOTYPE CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ NƯỚC CHÂU Á Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS STEPHEN BAKER TP HỒ CHÍ MINH – 2010 Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tiến sỹ Stephen Baker, người trực tiếp hướng dẫn đề tài tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tiếp theo, xin cảm ơn tiến sỹ Trần Thụy Châu hướng dẫn thao tác sinh học phân tử q trình làm thí nghiệm chỉnh sửa luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bác sỹ James Campbell, anh Hoàng anh chị phịng thí nghiệm vi sinh đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford tận tình dạy tơi thao tác vi sinh giúp đỡ thời gian làm đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giảng dạy khoa Sinh Học trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian đại học cao học Tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến thành viên gia đình tơi hỗ trợ mặt tinh thần suốt thời gian thực đề tài Cuối xin cảm ơn anh chị đồng nghiệp bên cạnh động viên, chia kiến thức, kinh nghiệm giúp đỡ tơi mặt q trình làm đề tài i MỤC LỤC Lời Cảm ơn Mục lục…………………………………………………………………………… i Danh mục chữ viết tắt …………………………………………………………iv Danh mục bảng…………………………………………………………………v Danh mục hình vẽ…………………………………………………………… vi Giới thiệu……………………………………………………………… .vii Mục tiêu ý nghĩa đề tài……………………………………………………viii CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Danh pháp phân loại Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi (S.Typhi) 1.2 Đặc điểm cấu trúc sinh lý, sinh hóa S.Typhi 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc …4 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.3 Phương pháp phân lập định danh S.Typhi 1.4 Đặc điểm di truyền S.Typhi 1.5 Bệnh học sốt thương hàn S.Typhi 1.5.1 Nguồn lây bệnh đường truyền nhiễm 1.5.2 Triệu chứng lâm sàng 1.5.3 Sự phát sinh bệnh S.Typhi 1.5.4 Phòng bệnh sốt thương hàn 1.5.5 Điều trị sốt thương hàn 10 1.6 Tình hình kháng kháng sinh S.Typhi dịch tễ học sốt thương hàn giới Việt Nam 10 1.6.1 Tình hình kháng kháng sinh S.Typhi dịch tễ học sốt thương hàn giới 10 1.6.2 Tình hình kháng kháng sinh S.Typhi dịch tễ học sốt thương hàn Việt Nam 13 ii 1.7 Các phương pháp phân biệt S.Typhi nghiên cứu dịch tễ tìm hiểu cấu trúc di truyền quần thể S.Typhi 14 1.7.1 Các phương pháp cổ điển dựa kiểu hình 14 1.7.2 Các phương pháp phân tử dựa vào DNA 16 1.8 Phát triển phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) phân biệt chủng S.Typhi 20 1.8.1 Giới thiệu phương pháp MLPA 20 1.8.2 Nguyên tắc MLPA 22 1.8.3 Ưu điểm kỹ thuật MLPA 23 1.9 Golden gate SNP typing 23 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Qui trình thực nghiệm 26 2.3 Hóa Chất – Thiết Bị - Phương Pháp Tiến Hành 26 2.3.1 Định danh vi khuẩn 27 2.3.1.1 Định danh thử nghiệm sinh hóa 27 2.3.1.2 Định danh sinh hóa Kít Api 20E (Biomerieux, Paris, Pháp) 29 2.3.1.3 Định danh dựa phản ứng ngưng kết kháng nguyên–kháng thể 30 2.3.2 Xác định kháng sinh đồ nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum inhibitory concentration) 32 2.3.3 Tách chiết DNA gen S.Typhi Wizard (Promega ) Kít 34 2.3.4 SNP typing Golden gate Assay 35 2.3.5 Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification (MLPA) 35 2.3.5.1 Thiết kế mẫu dò 35 2.3.5.2 Quá trình thực MLPA 38 2.3.5.3 Phân tích sản phẩm MLPA 39 2.3.6 PCR thông thường 42 2.3.7 Dựng phát sinh loài (phylogenetic tree) từ liệu SNP typing liệu MLPA) 43 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN iii 3.1 Kết xác nhận S.Typhi phản ứng sinh hóa Kít Api 20E 44 3.2 Kết kháng sinh đồ MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) chủng S.Typhi phân lập Việt Nam nước Châu Á 44 3.2.1 Tỉ lệ đa kháng thuốc kháng nalidixic acid (Na) chủng S.Typhi phân lập Việt Nam 45 3.2.2 Tỉ lệ đa kháng thuốc kháng nalidixic acid (Na) chủng S.Typhi phân lập số nước Châu Á 46 3.2.3 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) OFX (ofloxacin) CIP (ciprofloxacin) chủng S.Typhi phân lập từ Việt Nam nước Châu Á 48 3.2.4 Đánh giá giới hạn kháng-nhạy (breakpoint) với ciprofloxacin ofloxacin theo hướng dẫn CLSI nay: 49 3.3 Kết SNP typing Golden gate assay 52 3.4 Kết phân loại chủng S.Typhi phương pháp MLPA 54 3.4.1 Kết phát đoạn gắn chèn-bị S.Typhi MLPA 54 3.4.2 Kiểm tra độ xác phương pháp MLPA chủng chứng 56 3.4.3 So sánh kết xác định haplotype S.Typhi Golden gate SNP typing MLPA 57 3.4.4 Kết phân tích liên quan kiểu gen kiểu hình 217 S.Typhi phương pháp MLPA 60 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 65 4.2 ĐỀ NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… ix PHỤ LỤC……………………………………………………………………… xxiii iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp CIP CLSI GTR In-del IS KIA Kb MDR MH MIC MLEE MLPA MLST NA Na NaR mg/l OFX PFGE PSO RAPD RFLP SPIs S.Typh i TBE µg/ml UV Base pair Ciprofloxacin Clinical and Laboratory Standards Institute General time-reversible insertion-deletion Insertion sequence Kligler Iron Agar Kilobase Multiple drug resistant Muller-Hinton Minimum inhibotory concentration Multilocus enzyme electrophoresis Multiplex ligation dependent-probes amplification Multilocuc sequence typing Nutrient agar Nalidixic acid Nalidixic acid resistant Miligam/lít Ofloxacin Pulsed- Field Gel Electrophoresis Polyvalent O Random amplified polymorphic DNA Restriction fragment length polymorphism Salmonella Pathogenicity islands Salmonella enterica serovar Typhi Tris-borat / EDTA Microgam/mililít Ultra violet v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang 1.1……………………………………………………………………… 2.1……………………………………………………………………… 27 2.2……………………………………………………………………… 34 2.3……………………………………………………………………… 37 2.4……………………………………………………………………… 43 3.1……………………………………………………………………… 45 3.2……………………………………………………………………… 48 3.3……………………………………………………………………… 52 3.4……………………………………………………………………… 56 3.5……………………………………………………………………… 57 3.6……………………………………………………………………… 60 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Trang vi 1.1……………………………………………………………………….3 1.2……………………………………………………………………….4 1.3……………………………………………………………………….11 1.4……………………………………………………………………….12 1.5……………………………………………………………………….13 1.6……………………………………………………………………….18 1.7……………………………………………………………………….21 1.8……………………………………………………………………….22 1.9……………………………………………………………………….25 2.1……………………………………………………………………….29 2.2……………………………………………………………………….30 2.3……………………………………………………………………….31 2.4……………………………………………………………………….32 2.5……………………………………………………………………….40 2.6……………………………………………………………………….41 2.7……………………………………………………………………….42 3.1……………………………………………………………………….46 3.2……………………………………………………………………….50 3.3……………………………………………………………………….51 3.4……………………………………………………………………….53 3.5……………………………………………………………………….55 3.6……………………………………………………………………….55 3.7……………………………………………………………………….62 Giới thiệu Salmonella Typhi nguyên nhân gây bệnh sốt thương hàn Việt Nam giới Theo thống kê, số ca nhiễm hàng năm lên đến 16-33 triệu ca với khoảng 500.000-600.000 người chết [9] Bệnh lây truyền qua đường vii phân-miệng nên phổ biến nước phát triển, đặc biệt nước Châu Á Châu Phi [109] Kháng sinh biện pháp hiệu điều trị sốt thương hàn Tuy nhiên tình hình kháng thuốc lan tràn không ngừng gia tăng S.Typhi gây nhiều khó khăn điều trị [70] Nghiêm trọng gia tăng quần thể S.Typhi đa kháng thuốc (kháng với chloramphenicol, ampicillin co-trimoxazole) kết hợp kháng nalidixic acid So với chủng nhạy chủng đa kháng thuốc gây bệnh nặng hơn; tỉ lệ biến chứng tử vong cao đặc biệt trẻ em tuổi giới hạn kháng sinh điều trị [109] Không thế, tỉ lệ mang S.Typhi mãn tính sau điều trị cịn cao gấp 10 lần so với sốt thương hàn gây chủng nhạy [70] S.Typhi kháng nalidixic acid (kháng sinh hệ I thuộc họ quinolone) gây giảm nhạy với fluoroquinolone, họ kháng sinh chủ yếu điều trị sốt thương hàn Sự giảm nhạy với fluoroquinolone chủng S.Typhi thường dẫn đến việc điều trị kéo dài, nguy thất bại cao tăng gánh nặng điều trị [3, 8, 33, 49, 59, 78, 82] Do đó, sốt thương hàn gây chủng S.Typhi đa kháng kết hợp kháng nalidixic acid quan tâm nhiều nước phát triển Nghiên cứu dịch tễ cấu trúc di truyền quần thể S.Typhi quan trọng cần thiết để tìm hiểu lây lan, ngăn chặn bùng phát bệnh tương lai có phát đồ điều trị hợp lý Tuy nhiên, nghiên cứu gặp nhiều khó khăn chủng S.Typhi có tính tương đồng di truyền cao Vi khuẩn ổn định mặt di truyền, mức độ đa dạng trình tự thấp, so sánh vài trình tự gen thường khơng phân biệt dịng S.Typhi [54] Do để phân biệt chủng S.Typhi cần phải có phương pháp nghiên cứu sâu Với phát triển khơng ngừng kỹ thuật giải trình tự tự động SNP typing (Single Nucleotide Polymorphism typing)- phương pháp phân biệt dựa vào đa hình trình tự nucleotide xem phương pháp chuẩn Tuy nhiên phương pháp tốn kém, đòi hỏi thời gian thiết bị kỹ thuật đắt tiền nên áp dụng vùng dịch tễ sốt thương hàn thường vùng kinh tế thấp viii Mục tiêu ý nghĩa đề tài Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tơi muốn phát triển phương pháp giúp xác định nhanh kiểu di truyền S.Typhi cách đơn giản, có hiệu phân biệt cao, lặp lại Phương pháp áp dụng phịng thí nghiệm sinh học phân tử thông thường Việt Nam nước phát triển Phương pháp hứa hẹn trở thành công cụ hiệu nghiên cứu dịch tễ học giúp tìm hiều nguồn gốc lây lan dịch bệnh, đường lan truyền, tìm hiểu mối quan hệ kiểu gen với vùng địa lý, mối quan hệ kiểu gen với kiểu hình kháng thuốc; nguồn gốc tiến hóa kiểu gen khác S.Typhi…Ngồi phương pháp cịn giúp xác định cấu trúc di truyền quần thể S.Typhi vùng định, điều mà trước tiếp cận phương pháp thông thường xviii Barrell (2001), "Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18", Nature, 413, pp 848-52 [69] Parry, C., J Wain, N T Chinh, H Vinh, and J J Farrar (1998), "Quinolone-resistant Salmonella typhi in Vietnam", Lancet, 351, pp 1289 [70] Parry, C M (2004), " The treatment of multi- drug-resistant and nalidixic acid-resistant typhoid fever in Viet Nam", Royal Society of Tropical Medicine And Hygiene, 69, pp 1-10 [71] Parry, C M (2004), "Typhoid Fever", Curr Infect Dis Rep, 6, pp 27-33 [72] Parry, C M., T T Hien, G Dougan, N J White, and J J Farrar (2002), "Typhoid fever", N Engl J Med, 347, pp 1770-82 [73] Parry, C M., V A Ho, T Phuong le, P V Bay, M N Lanh, T Tung le, N T Tham, J Wain, T T Hien, and J J Farrar (2007), "Randomized controlled comparison of ofloxacin, azithromycin, and an ofloxacinazithromycin combination for treatment of multidrug-resistant and nalidixic acid-resistant typhoid fever", Antimicrob Agents Chemother, 51, pp 81925 [74] Parry, C M., C T Thuy, S Dongol, A Karkey, H Vinh, N T Chinh, P T Duy, T V Nga, J I Campbell, N V Hoang, A Arjyal, Z A Bhutta, S K Bhattacharya, M D Agtini, B Dong, D G Canh, A Naheed, J Wain, T T Hien, B Basnyat, L Ochiai, J Clemens, J J Farrar, C Dolecek, and S Baker "Suitable disk antimicrobial susceptibility breakpoints defining Salmonella enterica serovar Typhi isolates with reduced susceptibility to fluoroquinolones", Antimicrob Agents Chemother, pp [75] Popoff, M Y., and L Le Minor (1997), "Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7th revision", World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Pasteur Institute, Paris, France., pp xix [76] Quintaes, B R., N C Leal, E M Reis, and E Hofer (2004), "Optimization of randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction for molecular typing of Salmonella enterica serovar Typhi", Rev Soc Bras Med Trop, 37, pp 143-7 [77] Rahman, M., A K Siddique, S Shoma, M A S Harunur Rashid, Q S Ahmed, G B Nair, and R F Breiman 2002 Rapid Emergence of Multidrug-resistant Salmonella enterica Serovar Typhi with Decreased Ciprofloxacin Susceptibility in Bangladesh Asian Conference on Diarrhoeal Diseases and Nutrition (ASCODD) [78] Rahman, M., A K Siddique, S Shoma, H Rashid, M A Salam, Q S Ahmed, G B Nair, and R F Breiman (2006), "Emergence of multidrugresistant Salmonella enterica serotype Typhi with decreased ciprofloxacin susceptibility in Bangladesh", Epidemiol Infect, 134, pp 433-8 [79] Raveendran, R., C Wattal, A Sharma, J K Oberoi, K J Prasad, and S Datta (2008), "High level ciprofloxacin resistance in Salmonella enterica isolated from blood", Indian J Med Microbiol, 26, pp 50-3 [80] Renuka, K., S Sood, B K Das, and A Kapil (2005), "High-level ciprofloxacin resistance in Salmonella enterica serotype Typhi in India", J Med Microbiol, 54, pp 999-1000 [81] Rodrigues, C., A Mehta, and V R Joshi (1998), "Quinolone resistant enteric fever problems and remedies", J Assoc Physicians India, 46, pp 751-2 [82] Rotimi, V O., W Jamal, T Pal, A Sonnevend, T S Dimitrov, and M J Albert (2008), "Emergence of multidrug-resistant Salmonella spp and isolates with reduced susceptibility to ciprofloxacin in Kuwait and the United Arab Emirates", Diagn Microbiol Infect Dis, 60, pp 71-7 [83] Roumagnac, P., F X Weill, C Dolecek, S Baker, S Brisse, N T Chinh, T A Le, C J Acosta, J Farrar, G Dougan, and M Achtman (2006), "Evolutionary history of Salmonella typhi", Science, 314, pp 1301-4 xx [84] Rupali, P., O C Abraham, M V Jesudason, T J John, A Zachariah, S Sivaram, and D Mathai (2004), "Treatment failure in typhoid fever with ciprofloxacin susceptible Salmonella enterica serotype Typhi", Diagn Microbiol Infect Dis, 49, pp 1-3 [85] Saha, S K., and e al 1999 A highly ceftriaxone-resistant Salmonella typhi in Bangladesh Institute of Public Health [86] Schouten, J P., C J McElgunn, R Waaijer, D Zwijnenburg, F Diepvens, and G Pals (2002), "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification", Nucleic Acids Res, 30, pp e57 [87] Selander, R K., P Beltran, N H Smith, R Helmuth, F A Rubin, D J Kopecko, K Ferris, B D Tall, A Cravioto, and J M Musser 1990 Evolutionary genetic relationships of clones of Salmonella serovars that cause human typhoid and other enteric fevers, vol 58 [88] Sen, B., S Dutta, D Sur, B Manna, A K Deb, S K Bhattacharya, and S K Niyogi (2007), "Phage typing, biotyping & antimicrobial resistance profile of Salmonella enterica serotype Typhi from Kolkata", Indian J Med Res, 125, pp 685-8 [89] Seon Young Choi, Yoon-Seong Jeon,1,3 Je Hee Lee,1,2 Boram Choi,1, L v S Sun Hwa Moon, John D Clemens,1, J W Gordon Dougan, Jun Yu,4 Je Chul Lee,5 Sung Yong Seol,5, J.-H S Bok Kwon Lee, Manki Song,1 Cecil Czerkinsky,1, and Jongsik Chun1, and Dong Wook Kim (2007), "Multilocus sequence typing analysis of Shigella flexneri isolates collected in Asian countries", Journal of Medical Microbiology, pp [90] Shangkuan, Y H., and H C Lin (1998), "Application of random amplified polymorphic DNA analysis to differentiate strains of Salmonella typhi and other Salmonella species", J Appl Microbiol, 85, pp 693-702 [91] Shen, R., J B Fan, D Campbell, W Chang, J Chen, D Doucet, J Yeakley, M Bibikova, E Wickham Garcia, C McBride, F Steemers, F xxi Garcia, B G Kermani, K Gunderson, and A Oliphant (2005), "Highthroughput SNP genotyping on universal bead arrays", Mutat Res, 573, pp 70-82 [92] singleton, P (2000), "DNA methods in clinical microbiology", pp [93] Slater, H., D Bruno, H Ren, P La, T Burgess, L Hills, S Nouri, J Schouten, and K H Choo (2004), "Improved testing for CMT1A and HNPP using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) with rapid DNA preparations: comparison with the interphase FISH method", Hum Mutat, 24, pp 164-71 [94] Sood, S., A Kapil, B Das, Y Jain, and S K Kabra (1999), "Re-emergence of chloramphenicol-sensitive Salmonella typhi", Lancet, 353, pp 1241-2 [95] Špela Stangler Herodež, B Z., and Nadja Kokalj Vokač (2005), "MLPA Method for PMP22 Gene Analysis", Acta Chim Slov, pp [96] Stephen Baker1, C M P., 2*, Chau Tran Thuy1, 2, Sabina Dongol3, Abhilasha Karkey3,Ha Vinh1, 4, Nguyen Tran Chinh4, Pham Thanh Duy1, 2, Tran Vu Thieu Nga1, 2, James I Campbell1, 2, Nguyen Van Minh Hoang1, 2, Amit Arjyal3, Zulfiqar A Bhutta5, Sujit K Bhattacharya6, Magdarina D Agtini7, Baiqing Dong8, Do Gia Canh9, Aliya Naheed10, John Wain11, Tran Tinh Hien1,4, Christiane Dolecek1, 2, Buddha Basnyat3, Leon Ochai12, John Clemens12, Jeremy J Farrar1, (2010), "Suitable disk antimicrobial susceptibility breakpoints defining Salmonella enterica serovar Typhi isolates with reduced susceptibility to fluoroquinolones", AAC, pp [97] Sutton, I J., A P Mocroft, V H Lindley, R M Barber, R J Bryon, J B Winer, and F MacDonald (2004), "Application of multiplex ligationdependent probe analysis to define a small deletion encompassing PMP22 exons and in hereditary neuropathy with liability to pressure palsies", Neuromuscul Disord, 14, pp 804-9 xxii [98] Swaminathan, B., and G M Matar (1993), "Molecular typing methods", pp [99] Thong, K L., Y M Cheong, S Puthucheary, C L Koh, and T Pang (1994), "Epidemiologic analysis of sporadic Salmonella typhi isolates and those from outbreaks by pulsed-field gel electrophoresis", J Clin Microbiol, 32, pp 1135-41 [100] Threlfall, E J., L R Ward, J A Skinner, H R Smith, and S Lacey (1999), "Ciprofloxacin-resistant Salmonella typhi and treatment failure", Lancet, 353, pp 1590-1 [101] Turner, A K., S Nair, and J Wain (2006), "The acquisition of full fluoroquinolone resistance in Salmonella Typhi by accumulation of point mutations in the topoisomerase targets", J Antimicrob Chemother, pp [102] Wain, J., N T Hoa, N T Chinh, H Vinh, M J Everett, T S Diep, N P Day, T Solomon, N J White, L J Piddock, and C M Parry (1997), "Quinolone-resistant Salmonella typhi in Viet Nam: molecular basis of resistance and clinical response to treatment", Clin Infect Dis, 25, pp 140410 [103] Ward, E J T a L R (2001), "Ciprofloxacin-resistant Salmonella typhi and treatment failure", Emerging infectous diseases, 7, pp [104] WHO 2003, posting date Backgound document:The diagnosis, treatment and prevention of typhoid fever Department of Vaccines and BiologicalsWorld Health Organization [Online.] [105] WHO (2003), "Background document: The diagnosis, treatment and prevention of typhoid fever", pp [106] WHO (1999), "Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guideline_M26-A", pp [107] WHO (2008), "Typhoid vaccines: WHO position paper", Wkly Epidemiol Rec, 83, pp 49-59 xxiii [108] Who (2003), "Vaccines, Immunization and biologicals- Typhoid vaccines", pp [109] WHO (2008), "Weekly epidemiological record Relevé épidémiologique hebdomadaire", pp [110] Woodward, T E., J E Smadel, and et al (1948), "Preliminary report on the beneficial effect of chloromycetin in the treatment of typhoid fever", Ann Intern Med, 29, pp 131-4 NGUỒN INTERNET: [111] www.sanger.ac.uk/Projects/S.Typhi/CDC/STY2499.shtml [112] www.Illumina.com PHỤ LỤC Phụ lục Mẫu bảng kết định danh: STT Tên chủng KIA Gas H2S Di động Indol Citrate Urea Đỏ Methyl xxiv Mẫu bảng kết thử nghiệm ngưng kết kháng huyết STT Tên chủng PSO O9 O2 Vi Kết xxv Phụ lục 2: Danh sách chủng gửi viện Sanger để làm SNP typing Golden gate Assay Số thứ tự Tên chủng Quốc gia năm Nguồn gốc AS18977 AS31279 AS32308 AS-3808 AS-9242 Bangladesh Bangladesh Bangladesh Bangladesh Bangladesh 2003 2003 2003 2003 2003 Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập xxvi 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Doni C26 Doni C36 Doni C4 Doni C42 DoniC51 B116 D15 C161 D43 B45 J-2018XM J-359BM J-80YM L250 L368 L54 L599 UI-5106 BL16599 BL21095 BL2513 BL3723 BL820 113 255 304 318 436 1592 1697 1727 2017 2062 2694 3069 4313 5623 7560 8071 8699 8951 9019 9183 ct111 Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Indonesia Indonesia Indonesia Lào Lào Lào Lào Lào Pakistan Pakistan Pakistan Pakistan Pakistan Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam 2002 2002 2002 2002 2002 2004 2004 2004 2004 2004 2002 2002 2002 2004 2004 2004 2004 2004 2003 2003 2003 2003 2003 1994 1999 1998 1999 2001 1999 2000 2001 2001 2000 1995 2000 1995 1995 1996 1996 1996 1996 1994 1996 1994 Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập xxvii 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 10877 ct143 14308 14635 AG 112 AG 152 AG 165 AG 169 AG 175 AG 25 AG 26 AG 33 AG 336 AG 45 AG 53 DT DT 47 DTY1_94 HTD798 HTD810 Ly Van Tan Ty.05909 V.04844 V.07641 E98-2068 E98-3139 AG3 8(04)-N E02-2759 E03-9804 ISP-03-07467 ISP-04-06979 CT18 E03-4983 404ty E00-7866 E02-1180 E98-0664 J185SM M223 150(98)S Ty2 E00-6750 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Bangladesh Mexico Việt Nam Việt Nam Ấn Độ Ấn Độ Ma rốc Trung Phi Việt Nam Indonesia Indonesia Ma rốc Ấn Độ Kenya Indonesia Unknown Việt Nam Nga Senegal 1996 2001 1997 1997 2004 2005 2005 2005 2005 2003 2005 2003 2004 2004 2004 2002 2002 1997 2003 2003 2006 2004 2004 2004 1998 1998 2004 2004 2002 2003 2003 2004 1993 2003 1983 2000 2002 1998 1985 1939 1998 1916 2001 Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Phân lập Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control Control xxviii Phụ lục 3: Kết MIC OFX (ofloxacin) 217 chủng S.Typhi phân lập Việt Nam nước Châu Á Nước Số chủng Việt Nam Ấn Độ Bangladesh Pakistan Trung Quốc Indonesia Lao Nepal Tổng 89 29 17 18 S.Typhi nhạy Nalidixic acid Số chủng MIC với OFX 0.032-0.064 0.032-0.047 10 0.032-0.094 10 0.032-0.125 16 14 21 14 217 15 14 20 11 98 0.032-0.125 0.032-0.064 0.032-0.125 0.032-0.19 0.032-0.19 S.Typhi kháng Nalidixic acid Số chủng MIC với OFX 79 0.125-3 20 0.19-12 0.75 0.38-0.5 1 119 0.5 0.25 0.5 0.125-12 xxix Kết MIC CIP (ciprofloxacin) 217 chủng S.Typhi phân lập Việt Nam nước Châu Á Nước Số chủng Việt Nam Ấn Độ Bangladesh Pakistan Trung Quốc Indonesia Lào Nepal Tổng 88 29 17 18 16 14 21 14 217 S.Typhi nhạy Nalidixic acid Số chủng MIC với CIP 0.008-0.016 0.006-0.125 10 0.006-0.023 10 0.008-0.047 15 0.008-0.032 14 0.008-0.032 20 0.008-0.016 11 0.008-0.125 98 0.006-0.125 S.Typhi kháng Nalidixic acid Số chủng MIC với CIP 79 0.064-0.5 20 0.064-6 0.25-0.38 0.125-0.25 0.25 0 0.064 0.38-0.5 119 0.064-6 Phụ lục 4: Kiểu haplotype 73 chủng S.Typhi làm SNP typing phương pháp Golden gate Assay Nước Năm phân lập Việt Nam 1994 - 2004 Bangladesh 2003 Trung Quốc 2002 Ấn Độ 2004 Indonesia 2002 Lào 2004 Số chủng (n = 73) 42 4 2 Kiểu Haplotype H1 H58 H42 H58 H50 H52 H50 H58 H50 H59 H1 H52 xxx Pakistan 2003 1 H58 H42 H50 H58 Phụ lục 5: Phân nhóm chủng S.Typhi dựa kiểu đoạn gắn chèn-bị mất, kết hợp với kiểu hình đột biến gen gyrA; kháng nalidixic acid-NaR MDR Đoạn gắn chèn-bị K,B,C K,B K K,B,C,E,N K,B,C,E K,B,C,E,S K,S K,B,C,S K,E K,B,C,E,D K,B,F Khơng có đoạn gắn chèn-bị Số chủng 12 39 21 10 121 1 GyrA 94 0 0 NaR 10 100 0 0 MDR 74 0 0 0 xxxi Phụ lục 6: Sự phân loại nhóm chủng S.Typhi theo nước dựa kiểu đoạn gắn chèn-bị mất; kết hợp với kiểu hình đột biến gen gyrA; kháng nalidixic acid-NaR MDR Nước Việt Nam Ấn Độ Bangladesh Pakistan Nepal Đoạn gắn chèn-bị K,B,C,E K,B,C,E,S K,B K,B,C K,B,C,E K,B,C,E,N K,B K,E K K,B,C,E K,B K,B,C K,B,F K K,B,C,E K K,B K,B,C,E,N K,B K,B,C,E,N K K,B,C,E Số chủng 81 18 1 1 6 GyrA 78 1 0 0 0 2 0 NaR 76 11 1 0 0 0 0 MDR 53 3 0 0 0 0 0 0 0 xxxii Trung Quốc Lào Indonesia K,B,C K,S K,B K Khơng có đoạn gắn chèn-bị K,B K,B,C,E K K,B,C,S K,B,C,E,D K,B K K,B,C 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ... acid (Na) chủng S .Typhi phân lập số nước Châu Á 46 3.2.3 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) OFX (ofloxacin) CIP (ciprofloxacin) chủng S .Typhi phân lập từ Việt Nam nước Châu Á ... thiểu) chủng S .Typhi phân lập Việt Nam nước Châu Á 44 3.2.1 Tỉ lệ đa kháng thuốc kháng nalidixic acid (Na) chủng S .Typhi phân lập Việt Nam 45 3.2.2 Tỉ lệ đa kháng thuốc kháng nalidixic... pháp MLPA 54 3.4.1 Kết phát đoạn gắn chèn-bị S .Typhi MLPA 54 3.4.2 Kiểm tra độ xác phương pháp MLPA chủng chứng 56 3.4.3 So sánh kết xác định haplotype S .Typhi Golden gate SNP typing MLPA