BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH HUYỀN PHÂN LẬP VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SPP. TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU THỊ TRÊN ðỊA BÀN NỘI THÀNH HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. ðỖ NGỌC THÚY TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện với sự giúp ñỡ của cán bộ, công nhân viên Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. ðỗ Ngọc Thúy. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong công trình nghiên cứu nào khác. Các tài liệu trích dẫn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ, tên tác giả. Hà nội, ngày tháng năm 2010 Người cam ñoan Phạm Thị Thanh Huyền Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. ðỗ Ngọc Thúy, Viện Thú y Quốc gia, ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Bá Hiên, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa thú y - Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã ñóng góp những ý kiến quý báu giúp tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn này. Tôi xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Hồng Sơn, Viện trưởng Viện Môi trường Nông nghiệp, Th.S. Lương Hữu Thành, Trưởng Bộ môn Sinh học Môi trường ñã tạo ñiều kiện thuận lợi, tận tình giúp ñỡ và ñộng viên trong suốt quá trình hoàn thiện luận văn này. Tôi xin ñược bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Viện ðào tạo sau ñại học - Trường ðH Nông nghiệp Hà nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt hai năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin ñược gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia, tập thể Bộ môn Sinh học môi trường, gia ñình và bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên, cổ vũ và giúp ñỡ trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Hà nội, ngày tháng năm 2010 Người viết Phạm Thị Thanh Huyền Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề: 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu: 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tình hình ngộ ñộc thực phẩm trên thế giới và tại Việt Nam 4 2.2. Các nguyên nhân gây ngộ ñộc thực phẩm. 9 2.3. Ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm có nguồn gốc ñộng vật 15 2.4. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella gây ô nhiễm thực phẩm và ngộ ñộc ở người. 18 2.5. Các biện pháp phòng chống ô nhiễm ngộ ñộc thực phẩm nói chung và Salmonella nói riêng. 20 2.6. Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella 23 2.7. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella 27 2.8. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella 29 2.9. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella trên thực phẩm tại Việt Nam 35 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1. ðối tượng, ñịa ñiểm, thời gian nghiên cứu: 38 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iv 3.2. Nội dung nghiên cứu: 38 3.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu: 38 3.4. Phương pháp nghiên cứu: 40 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 4.1. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong các loại mẫu thịt 49 4.1.1. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong mẫu thịt lợn, bò, gà. 49 4.1.2. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong các mẫu thu thập tại chợ tự do 52 4.1.3. Kết quả xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong các mẫu thu thập tại siêu thị. 54 4.2. Tần suất chợ và siêu thị có mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella spp. 56 4.3. Kết quả giám ñịnh các ñặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 60 4.4. Kết quả xác ñịnh serovar của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 66 4.5. Sự phân bố của các serovar trong các mẫu thịt: 69 4.6. Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 71 4.7. Kết quả xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 75 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 80 5.1. Kết luận. 80 5.2. ðề nghị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infusion CHO Chinese Hamster Ovary cell DHL: Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar DPF Delayed Permeability Factor HACCP Hazard Analysis Critical Control Point LIM Lysine Indole Motility LPS Lipopolysaccharide LT Heat Labile Toxin NCCLS National committee for Clinical Standards NðTP Ngộ ñộc thực phẩm RPF Rapid Permeability Factor RV Rappaports Vassiliadis TSI Triple Sugar Iron VK Vi khuẩn VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG 3.1. Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm của vi khuẩnvới một số loại kháng sinh 46 3.2. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm 47 4.1. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu thịt 50 4.2. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. Từ mẫu thịt tại chợ tự do 52 4.3. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. Từ mẫu thịt tại siêu thị 55 4.4. Tần suất chợ và siêu thị có mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella spp. 57 4.5. Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 61 4.6. Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 63 4.7. Công thức kháng nguyên của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 67 4.8. Sự phân bố của các serovar trong số các chủng Salmonella spp. phân lập ñược 70 4.9. Kết quả xác ñịnh các gen mã hóa một số yếu tố ñộc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 72 4.10. Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1. Quy trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella từ các mẫu thịt (theo Bộ môn Vi trùng - Viện thú y Quốc gia) 41 4.1. Biểu ñồ so sánh số mẫu dương tính với số mẫu kiểm tra 51 4.2. Biểu ñồ so sánh số mẫu dương tính với số mẫu kiểm tra tại chợ tự do 53 4.3. Biểu ñồ so sánh số mẫu dương tính với số mẫu kiểm tra tại siêu thị 55 4.4. Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm Samonela spp. giữa chợ tự do và siêu thị 56 4.5. Tần suất chợ và siêu thị dương tính với vi khuẩn Salmonella spp. 57 4.6. Biểu ñồ tỷ lệ xác ñịnh gen mã hóa một số yếu tố ñộc lực của vi khuẩn Salmonella spp. phân lập ñược 73 4.7. Biểu ñồ so sánh tính kháng và tính mẫn cảm với thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp.phân lập ñược 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp viii DANH MỤC ẢNH STT Tên ảnh Trang 4.1. Hình thái vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi (x1000 lần) 62 4.2. Vi khuẩn Salmonella trên môi trường Malonate 62 4.3. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM 64 4.4. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL 64 4.5. Phản ứng lên men ñường của vi khuẩn Salmonella 65 4.6. Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI 65 4.7. Kết quả của phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố ñộc lực của chủng VK Salmonella 74 4.8. Khả năng mẫn cảm hoặc kháng với kháng sinh của các chủng VK Salmonella spp. phân lập ñược 79 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề: Ở Việt Nam, trong những năm gần ñây, số vụ ngộ ñộc thực phẩm ngày càng tăng lên, ñã và ñang là mối quan tâm và lo ngại của toàn xã hội. Trên cả nước nói chung và khu vực Hà nội nói riêng, việc giết mổ gia súc, gia cầm còn phân tán ở nhiều ñiểm, vượt qua tầm kiểm soát của các cơ quan chức năng hiện nay; hoặc nếu ñược thực hiện trong các lò mổ thì các lò mổ này cũng chưa ñảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thú y. Do vậy, thực phẩm cung cấp cho người tiêu dùng chưa ñược an toàn, ngoài ra còn gây ô nhiễm môi trường, lây lan hoặc tái phát dịch bệnh nguy hiểm, gây nên những tổn thất nghiêm trọng về người và ảnh hưởng ñến tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh ñó, với khí hậu nhiệt ñới, nóng ẩm như ở nước ta thì nguy cơ vi sinh vật xâm nhiễm vào thịt, phát triển và gây ngộ ñộc cho người sử dụng là rất lớn. Chính vì vậy vấn ñề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn ñược ñưa lên hàng ñầu và là mối quan tâm của người tiêu dùng. Theo rất nhiều nghiên cứu thì các loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella từ lâu ñã ñược xác ñịnh là một trong số các tác nhân vi khuẩn thường gặp và quan trọng nhất, gây ra các vụ tiêu chảy do ngộ ñộc thực phẩm trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu là do người ăn phải các thức ăn bị nhiễm khuẩn. Các nhà khoa học ñã ước tính rằng, có tới 95% các trường hợp mắc bệnh tiêu chảy ở người là có liên quan ñến việc ăn phải các thực phẩm có nhiễm vi khuẩn này như thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, trứng và các sản phẩm tươi sống (Mead và cs, 1999) [58]. Vi khuẩn có mặt ở trong ñường tiêu hóa của ñộng vật và dễ dàng xâm nhập vào chuỗi (dây truyền) chế biến thực phẩm, gây ô nhiễm các loại thịt ñộng vật, ñặc biệt là thịt lợn, thịt gà, thịt bò, trứng và các sản phẩm tươi sống [...]... nh t trong th i gian g n ñây v th c tr ng ô nhi m vi khu n Salmonella spp trong s n ph m là th t tươi ñư c bán t i các ch và siêu th t i khu v c n i thành Hà N i, chúng tôi ñã ñ t v n ñ ti n hành nghiên c u ñ tài: Phân l p và xác ñ nh m t s ñ c tính sinh v t h c c a vi khu n Salmonella spp t th t tươi t i m t s ch và siêu th trên ñ a bàn n i thành Hà n i” Hy v ng, các k t qu nghiên c u c a ñ tài s... các bi n pháp v sinh thích h p ñ Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ nông nghi p .2 gi m thi u nguy cơ gây ng ñ c th c ph m ngư i do vi khu n Salmonella spp gây ra 1.2 M c tiêu nghiên c u: - Xác ñ nh t l ô nhi m v i vi khu n Salmonella spp trong th t tươi bán t i m t s ch và siêu th trên ñ a bàn Hà N i - Nghiên c u m t s ñ c tính c a các ch ng vi khu n Salmonella spp phân l p ñư c -... s ñ c ñi m c a vi khu n Salmonella Tr c khu n Salmonella thu c b Eubacteriales, h Enterobacteriaceae Gi ng Salmonella g m 2 loài: S enterica và S bongori ñã ñư c phân chia thành trên 3000 serotyp theo b ng phân lo i KauffmannWhite trên cơ s c u trúc c a kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và ñôi khi các kháng nguyên v (kháng nguyên K) G n ñây, loài S enterica ñã ñư c phân thành 6 phân loài, ñó... Sau 24 gi nuôi c y vi khu n phát tri n thành khu n l c tròn, l i, bóng láng (d ng S), có màu vàng nh t Các ch ng sinh H2S thì gi a khu n l c có màu ñen Môi trư ng th ch MacConkey: Vi khu n phát tri n thành nh ng khu n l c tròn l i, trong không màu, nh n bóng Trên môi trư ng th ch CHROMTM Salmonella, sau 24 gi nuôi c y, vi khu n hình thành khu n l c trơn, tròn, bóng láng (d ng S) và có màu tím h ng... xung quanh b i môi trư ng màu ñ sáng Trên môi trư ng th ch XLD: khu n l c màu ñen bóng, hơi l i 2.6.3 ð c tính sinh hoá Theo Quinn và cs (2004)[66], gi ng vi khu n Salmonella ñư c chia thành 7 phân nhóm, m i phân nhóm có kh năng lên men m t s lo i ñư ng nh t ñ nh và không ñ i Ph n l n phân loài S enterica subsp enterica gây b nh cho ñ ng v t máu nóng Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit, Mantoza,... i Do tính ch t gây b nh c a vi khu n Salmonella không nh ng cho gia súc, gia c m, ñ ng v t máu nóng, máu l nh và c trên ngư i nên t lâu trong nhân y và thú y, ngư i ta ñã quan tâm nghiên c u các ñ c tính sinh h c, y u t gây b nh và các bi n pháp phòng và ñi u tr b nh do chúng gây ra 2.5 Các bi n pháp phòng ch ng ô nhi m ng ñ c th c ph m nói chung và Salmonella nói riêng H i ñ ng chuyên gia v v sinh. .. có th tròn, m t hơi l i, rìa b m t và rìa hình khía răng cưa M t s serotyp ñôi khi hình thành các khu n l c d ng nh y như: S.paratyphi B Trên môi trư ng th ch Endo: Vi khu n Salmonella hình thành khu n l c màu tr ng h ng, tròn trơn, nh n bóng trông như nh ng h t sương long lanh trên màu h ng nh t c a môi trư ng Trên môi trư ng th ch Brilliant green: Salmonella hình thành khu n l c màu tr ng h ng, sáng,... ph m và gi th c ph m nhi t ñ l nh - Ng ñ c do ñ c t c a vi sinh v t (Foodborne intoxication): ð c t c a vi sinh v t ñư c s n sinh ra trong th c ph m trư c khi ngư i tiêu th ăn ph i, các quá trình b nh lý do ñ c t gây ra s phát sinh Ng ñ c do ñ c t vi sinh v t ít hơn so v i ng ñ c do nhi m vi sinh v t nhưng nguy hi m hơn vì t l t vong cao Có 2 lo i ñ c t : n i ñ c t và ngo i ñ c t Ngo i ñ c t do vi khu... như các ch ng vi khu n Salmonella ñ u không lên men Lactoza và Saccaroza Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ nông nghi p .25 ða s các vi khu n thu c gi ng Salmonella không làm tan ch y gelatin, không phân gi i urê, không s n sinh Indol Ph n ng MR, catalaza dương tính (tr S choleraesuis, S gallinarum-pullorum có MR âm tính) Ph n Oxidaza âm tính Ph n ng sinh H2S dương tính (tr ng S paratyphi... ) 2.2.2 Nguyên nhân do vi sinh v t Các tác nhân vi sinh v t gây ô nhi m th c ph m bao g m: vi khu n, virut, n m m c và ký sinh trùng Trư c tiên ph i k ñ n là các vi khu n: t , thương hàn, l tr c trùng, Clostridium, Bacillus, Brucella, Campylobacter, E.coli (ñ c bi t là E coli O157: H7), Salmonella, Listeria, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium Các virus có th gây các b nh . DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH HUYỀN PHÂN LẬP VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SPP. TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ CHỢ VÀ SIÊU. lập và xác ñịnh một số ñặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella spp. từ thịt tươi tại một số chợ và siêu thị trên ñịa bàn nội thành Hà nội Hy vọng, các kết quả nghiên cứu của ñề tài sẽ. Xác ñịnh tỷ lệ ô nhiễm với vi khuẩn Salmonella spp. trong thịt tươi bán tại một số chợ và siêu thị trên ñịa bàn Hà Nội - Nghiên cứu một số ñặc tính của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân