BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        NGUYỄN THỊ HẰNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ðỘC LƯU HÀNH TRÊN ðÀN VỊT TẠI MỘT SỐ TỈNH THUỘC ðỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI - 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng ñược công bố hay bảo vệ trong một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 25 tháng 08 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN! Trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài luận văn tại Khoa Thú y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, tôi ñã nhận ñược sự dạy bảo ân cần ñầy trách nhiệm của các thầy, cô giáo trong trường, Viện ñào tạo sau ñại học và ñặc biệt là các thầy, các cô trong Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy, các cô. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Bá Hiên là người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp này. Với tất cả lòng biết ơn tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình, cơ quan và các bạn ñồng nghiệp, ñã ñộng viên tạo mọi ñiều kiện, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Hằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Hepatitis) 3 2.2 Một số ñặc tính sinh học của virus viêm gan vịt 15 2.3 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 23 2.3.1 Miễn dịch thụ ñộng 24 2.3.2 Miễn dịch chủ ñộng 25 3 NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Nội dung nghiên cứu 27 3.2 Nguyên liệu nghiên cứu 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 29 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt cường ñộc 41 4.1.1 Kết quả phân lập virus trên phôi vịt 41 4.1.2 Kết quả phân lập virus trên vịt 49 4.2 Kết quả giám ñịnh virus viêm gan vịt bằng kĩ thuật RT-PCR 55 4.3 Kết quả khảo sát một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập ñược 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 4.3.1 Kết quả xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập ñược trên phôi vịt 57 4.2.2 Kết quả xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập ñược trên vịt 63 4.4 Kết quả xác ñịnh tính tương ñồng kháng nguyên giữa chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập ñược và virus vacxin nhược ñộc viêm gan vịt chủng DH – EG – 2000 thông qua phản ứng trung hòa 66 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 69 5.1 Kết luận 69 5.2 ðề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CNH - HðH : Công nghiệp hóa – Hiện ñại hóa XHCN : Xã hội chủ nghĩa DPV : Duck Picornavirus DHV : Duck Hepatitis Virus DNA : Axit Deoxyribonucleic RNA : Axit Ribonucleic OIE Office International Epizooties GDP Gross Dometic Product PCR : Polymerase Chain Reaction RT- PCR : Revese Transcription - Polymerase Chain Reaction ELD 50 : Embryo Lethal Dosis 50 Percent EID 50 : Embryo Infective Dosis 50 Percent LD 50 : Lethal Dosis 50 Percent EDTA : Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate NXB Nhà xuất bản X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase TAE : Tris Acetic acid EDTA cs : cộng sự Pp Pages Tr : trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Các ñoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 34 4.1 Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi vịt 43 4.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể của phôi vịt phân lập virus 46 4.3 Kết quả phân lập virus cường ñộc viêm gan vịt trên vịt con 50 4.4 Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của vịt con khi phân lập virus trên vịt con 52 4.5 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể ở vịt con khi phân lập virus trên vịt con 53 4.6 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% phôi vịt (ELD 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- NC. 57 4.7 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% phôi vịt (ELD 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- ðT 58 4.8 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% phôi vịt (ELD 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- AG 59 4 .9 Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm 50% phôi vịt (EID50) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- NC 60 4.10 Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm 50% phôi vịt (EID 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- ðT 61 4.11 Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm 50% phôi vịt (EID 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- AG 62 4 .12 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% vịt con (LD 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- NC 63 4.13 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% vịt con (LD 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- ðT 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii 4.14 Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% vịt con (LD 50 ) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc mẫu Navet- V- AG 65 4.15 Kết quả phản ứng trung hòa trên phôi vịt với mẫu Navet- V- NC 66 4.16 Kết quả phản ứng trung hòa trên phôi vịt với mẫu Navet- V- ðT và Navet-V-AG 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Hình thái cấu trúc virus viêm gan vịt 15 2.2 Cấu trúc không gian của picornavirus 17 2.3 Sơ ñồ hệ gen và chuỗi polypeptide của virus viêm gan vịt 19 4.1 Gan phôi xuất huyết 48 4.2 Phôi thí nghiệm, ñối chứng. 48 4.3 Phôi xuất huyết ñiểm 48 4.4 Phôi phù, xuất huyết 48 4.5 Tư thế nằm chết của vịt 54 4.6 Gan vịt bị xuất huyết 54 4.7 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR(~ 800 bp) của mẫu virus cường ñộc viêm gan vịt Navet- V- ðT, Navet- V- AG và Navet- V- NC trên thạch agarose 1%. 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Việt Nam bước vào thế kỷ 21, thời kỳ ñẩy mạnh CNH- HðH ñất nước theo ñịnh hướng XHCN. Dưới sự lãnh ñạo của ðảng, ñất nước ta ñã và ñang thu ñược nhiều thành tựu to lớn trên tất cả các lĩnh vực Chính trị- Kinh tế- Văn hoá- Xã hội. Trong ñường lối ñổi mới của mình, ðảng ta lấy ñổi mới kinh tế là trọng tâm, xây dựng ðảng là then chốt; lấy ñổi mới kinh tế làm ñộng lực chung cho sự phát triển toàn xã hội. ðảng ta chủ trương xây dựng và phát triển nền kinh tế hàng hoá nhiều thành phần vận hành theo cơ chế thị trường có sự quản lý của nhà nước theo ñịnh hướng XHCN. Tại ðại hội ðảng lần thứ VIII ñã chỉ rõ “ðẩy mạnh công cuộc ñổi mới một cách toàn diện và ñồng bộ, tiếp tục phát triển nền kinh tế nhiều thành phần, vận hành theo cơ chế thị trường, có sự quản lý của Nhà nước theo ñịnh hướng XHCN”. Thực hiện các nghị quyết của ðảng trong ñó phát triển ngành chăn nuôi cũng ñược ðảng và Nhà nước hết sức quan tâm. ðây là một ngành nhằm tạo ra nguồn thực phẩm chủ ñộng phục vụ cho ñời sống con người. Chính nhờ có chính sách ñổi mới như vậy, nền kinh tế nước ta ñã có những bước tăng trưởng rõ rệt. Tốc ñộ tăng trưởng GDP hằng năm ñạt từ 6- 8%. Do vậy ñời sống nhân dân ngày càng ñược cải thiện, nhu cầu về thực phẩm (Thịt- trứng- sữa ) của toàn xã hội tăng lên ngày càng cao. Nhu cầu về thực phẩm ngày càng tăng cao ñòi hỏi ngành chăn nuôi cần phải ñược quan tâm ñúng mức. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, ngành chăn nuôi gia cầm ñặc biệt là thủy cầm cũng ñang dần trở thành ngành sản xuất hàng hóa, góp phần vào chương trình xóa ñói giảm nghèo ở một số vùng nông thôn của nước ta ñặc biệt là ở một số tỉnh thuộc ñồng bằng sông Cửu Long. Vịt là loại thuỷ cầm ñược chăn nuôi nhiều nhất. Theo thống kê của Tổng cục thống kê, số lượng gia cầm năm 2008 là 248,3 triệu con, sơ bộ năm 2009 là 280,2 triệu con. Theo Cục khuyến nông, tổng số vịt trong cả nước năm 1998 là 37.376.000 con, năm 1999 là 39.207.000 con. Theo FAO (2003) Việt Nam có 57 triệu con vịt ñứng thứ 2 thế [...]... tình hình th c t trên chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài: “ Phân l p và xác ñ nh m t s ñ c tính sinh h c c a virus viêm gan v t cư ng ñ c lưu hành trên ñàn v t t i m t s t nh thu c ð ng b ng sông C u Long 1.2 M c ñích c a ñ tài - Phân l p virus viêm gan v t cư ng ñ c t i m t s t nh thu c ð ng b ng Sông C u Long - Xác ñ nh m t s ñ c tính sinh h c c a ch ng virus cư ng ñ c viêm gan v t phân l p ñư c... n hành nghiên c u các n i dung sau: 3.1.1 Phân l p virus cư ng ñ c viêm gan v t trên ñàn v t t i m t s t nh khu v c ð ng B ng Sông C u Long 3.1.2 Giám ñ nh ch ng virus cư ng ñ c viêm gan v t phân l p ñư c b ng kĩ thu t RT-PCR 3.1.3 Kh o sát m t s ñ c tính sinh h c c a ch ng virus cư ng ñ c viêm gan v t phân l p ñư c 3.1.3.1 Kh o sát m t s ñ c tính sinh h c c a ch ng virus cư ng ñ c viêm gan v t phân. .. trong viêm gan virus v t con ch y u th y gan và ñ i não Trong gan có nh ng ñám t bào b ho i t , viêm tăng sinh ng m t và xung quanh m ch, lúc ñ u là nh ng b ch c u h t sau ñó là t bào lympho và các tương bào m t n a s v t con th y các b nh tích viêm tăng sinh quanh m ch và viêm tăng sinh mô th n kinh ñ m S t n thương c a t bào gan v t con m c b nh viêm gan virus gi ng nh ng t n thương như viêm gan c... ñ n nay virus viêm gan v t typ II ch gây b nh Anh (Asplin, 1965) Năm 1969, ñ o Long( M ), b nh viêm gan v t ñã x y ra trên ñàn v t con ñã ñư c tiêm phòng vacxin như c ñ c typ I (Toth, 1969) B nh x y ra nh hơn so v i b nh viêm gan v t c a virus typ I, t l ch t c a v t con hi m khi vư t quá 30% Haider và Calnek ñã ñ t tên virus này là virus viêm gan v t typ III và cho ñ n nay virus viêm gan v t typ III... nhau là: virus viêm gan v t type I (DHV-1), type II(DHV-2) và type III(DHV-3) Ph bi n hơn c là virus viêm gan v t type I (Fabricant và Levine, 2002) virus viêm gan v t type II và type III m i ñư c tìm th y Anh và M , gây t l ch t không ñáng k (Woolcock, 2003) Hi n nay, v i s phát tri n c a sinh h c phân t , các nghiên c u sâu v gen/h gen, cũng như ngu n g c ph h c a các ch ng virus ñã xác ñ nh virus gây... c xác ñ nh trên M , Canada, Anh b nh viêm gan v t con thu c b nh truy n nhi m b t bu c ph i ăng ký như b nh Newcastle (Nguy n Xuân Bình, 1995) Năm 1965 b nh viêm gan v t x y ra Norfolk - Anh trên nh ng ñàn v t con ñã ñư c tiêm phòng vacxin như c ñ c viêm gan v t typ I B ng phương pháp b o h chéo trên v t ñã phân l p ñư c virus viêm gan v t typ II khác h n v i virus viêm gan v t typ I Cho ñ n nay virus. .. b nhi m virus viêm gan thư ng th y nư c i có màu xanh và gan b xanh - ñen, nh ng b nh tích này ít th y phôi gà (Nguy n ð c Lưu, 2001) - Trên phôi ng ng: Virus viêm gan v t cũng có kh năng nhân lên trên phôi ng ng Phôi ch t sau khi c y virus vào xoang ni u mô 2 - 3 ngày (Fabricant J and Levine P.P, 2002) - Trên phôi gà: Tiêm virus vào xoang ni u mô c a phôi gà 9 - 10 ngày tu i l n c y chuy n virus ñ... t l n hơn t 2-3 tu n tu i và gây t l ch t không ñáng k Nó gây ch t c p tính v t, tri u ch ng và b nh tích gi ng so v i type I Virus type II m t kh năng gây nhi m nhi t ñ 50oC trong vòng 60 phút * Virus viêm gan v t type III Virus viêm gan v t type III ñư c Toth phát hi n vào năm 1969 M (Toth, 1969), virus là m t Piconavirus, có tính kháng nguyên không quan h v i virus viêm gan v t type I, quan sát... huy t dư i da; gan, th n, lách sưng Trên phôi gà, virus viêm gan v t type III không có kh năng nhân lên môi trư ng t bào th n, gan c a phôi v t ho c c a v t con, virus có kh năng nhân lên, có th dùng môi trư ng này ñ xác ñ nh virus 2.2.2 C u t o virus viêm gan v t H gen c a virus viêm gan v t ch a acid ribonucleic (RNA) s i ñơn dương có ñ nucleotide dài khoàng 7600 – 7700 nucleotide và ñuôi poly A... nhi t ñ 50oC Virus cũng có th s ng pH t 3 - 9 trong vòng 48 gi Nh ng thu c tính này phù h p v i nhóm enterovirus (Davis, 1987) 2.2.4 ð c tính nuôi c y Virus viêm gan v t là lo i kí sinh n i bào tuy t ñ i (Nguy n ðư ng, 1990) ð gây b nh, c n s d ng huy n d ch các cơ quan c a v t con ch t do b nh viêm gan v t (gan, ph i, th n…) ñã ñư c x lí b ng kháng sinh Có th c y chuy n virus viêm gan v t trên ñ ng . ñích của ñề tài - Phân lập virus viêm gan vịt cường ñộc tại một số tỉnh thuộc ðồng bằng Sông Cửu Long. - Xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập ñược trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “ Phân lập và xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của virus viêm gan vịt cường ñộc lưu hành trên ñàn vịt tại một số tỉnh thuộc ðồng bằng sông Cửu Long . một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập ñược trên phôi vịt 57 4.2.2 Kết quả xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc viêm gan vịt phân lập