1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** ĐỖ THỊ MAI NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khãa 2009-2013 Hà Nội – 2013 1 1 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** ĐỖ THỊ MAI NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KhÓa 2009-2013 Giáo viên hướng dẫn:TS. Trần Vân Khánh Hà Nội – 2013 2 2 3 LỜI CẢM ƠN Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi học hỏi được rất nhiều, đó không chỉ là những kiến thức mà còn là tác phong và kinh nghiệm làm việc. Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Trần Vân Khánh, trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, phó giám đốc trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đã giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa luận cho tôi. PGS. TS. Tạ Thành Văn, PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, những người thầy tuy không trực tiếp hướng dẫn tôi làm khóa luân nhưng đã nhắc nhở, động viên không chỉ tôi mà tất cả các sinh viên, học viên đang tiến hành khóa luận tại trung tâm, tạo mọi thuận lợi cho chúng tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. ThS. Đỗ Ngọc Hải, khoa Hóa Sinh, bệnh viện Việt-Tiệp Hải Phòng, cùng tập thể labo nghiên cứu gen-protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài Ban giám hiệu, phòng quản lí và đào tạo đại học, bộ môn bệnh học phân tử và các phòng ban trong trường Đại học y Hà Nội Những người than trong gia đình, bạn bè, các anh chị đã động viên, chia sẻ khó khăn với tôi trong quá trình làm khóa luận. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013. Đỗ Thị Mai 3 3 4 Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc *** LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013 Người viết khóa luận Đỗ Thị Mai DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMD BMD DNA Duchene muscular dystropy Becker muscular dystrophy Deoxyribonucleic Acid cDNA Complimentary Deoxyribonucleic Acid 4 4 5 CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử CK Creatine kinase Kb PCR Kilo base Polymerase chain reaction MLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification NST Nhiễm sắc thể RNA dNTP ddNTP BN Ribo Nucleic Acid Deoxyribonucleoside triphosphate Dideoxyribonucleoside triphosphate Bệnh nhân 5 5 6 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne Muscular Dystrophy ( DMD) hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại được phát hiện trên nhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới là một bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, tiến triển mang tính chất tuần tiến, hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu cơ: biểu hiện là khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày càng nặng, cuối cùng dẫn tới tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và chết ở lứa tuổi 20 – 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, có chiều dài hơn 3000 Kb, bao gồm 79 exon với 7 promoter khác nhau. Gen sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổng hợp protein dystrophin. Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và được cho là có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Gen dystropin bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD. Một thể nhẹ hơn của DMD là Becker Muscular Dystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuất hiện muộn hơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn. Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn (khoảng 60%), đột biến điểm ( 25-30%), đột biến lặp ( 10-15%) 6 6 7 Như có thể thấy dạng đột biến xóa đoạn là phổ biến nhất, thường gặp nhất chiếm tỉ lệ trên một nửa số ca bệnh. Đột biến này thường xảy ra ở hai vùng trọng điểm (gọi là vùng hotspot) là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’. Cho đến nay DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi vậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ làm chậm lại các biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài ra,việc phát hiện đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh. Có nhiều phương pháp xác định đột biến xóa đoạn gen này nhưng do gen dystropin quá lớn với 79 exon, nên nhiều phương pháp gặp phải trở ngại về mặt thời gian. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là phương pháp xác định đột biến xóa đoạn và lặp đoạn nhanh chóng, chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi. Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne” được thực hiệnnhằm mục tiêu: Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA 7 7 8 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD. 1.1.1. Trên thế giới. - Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne . - Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt các bệnh cơ khác nhau và sau đó bệnh đã được mang tên ông - Năm 1879, Gowers đã thu thập 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ càng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết. - Bệnh DMD đã được biết hơn 100 năm, trong suốt một thời gian dài bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợ trong quá trình của bệnh đối với bệnh nhân. - Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK), phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền. - Cho đến năm 1981, Zatz và cộng sự đã phát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21. - Từ năm 1984 – 1987, Hoffman và các cộng sự của ông đã phát hiện ra gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen. 8 8 9 - Sau những năm 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di truyền phân tử đã phát triển mạnh nhằm phát hiện đột biến gen dystrophin, tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế tới mức thấp nhất sự sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD . - Năm 1987 - 1988, các nhà nghiên cứu mới chỉ biết gen dystrophin gồm 60 exon. - Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb - Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 3200 kb. Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh gây ra. Một hướng mà hiện nay được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu là chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ BMD bằng cách dùng một đoạn trình tự oligonucleotid đặc hiệu bám vào vị trí tăng cường quá trình ghép nối của exon, một vị trí quan trọng cho quá trình hoàn thiện mRNA để ngăn cản quá trình này, gây mất đoạn trực tiếp exon có chứa điểm đột biến, hoặc gây mất đoạn thêm một hoặc hai exon kề với vùng đột biến nhằm khôi phục lại khung dịch mã. Hướng nghiên cứu này trên tế bào đã đem lại nhiều kết quả rất đáng khích lệ, hiện nay đang được thử nghiệm trên động vật và bước đầu đã được ứng dụng trên người. Ngày nay, liệu pháp gen được coi là một trong các hướng nghiên cứu ưu tiên nhất đối với DMD. 9 9 10 1.1.2. Ở Việt Nam. DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gía trị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này. Cụ thể: - Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã nghiên cứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại Viện BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107 gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh. - Năm 1996, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Phượng và CS đã nghiên cứu giá trị của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen gây bệnh và đã nhận thấy khả năng phát hiện dị hợp tử của CK là 54%. - Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang đã sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ gen cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh. - Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biến xoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR. Tuy nhiên tác giả mới chỉ phân tích được một vài exon điển hình. - Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng đã công bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc tế lần thứ 23. - Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 đã nghiên cứu đột biến gen gây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6 trường hợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu. 10 10 [...]... trúc mô phỏng của Dystrophin và một số protein tương tác với nó 1.6 .Đột biến xóa đoạn gen Dystrophin Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và đột biến điểm Trong đó tỉ lệ các dạng đột biến: Đột biến xóa đoạn chiếm khoảng 60% Đột biến điểm chiếm 25-30% Đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 10-15% Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD/BMD Đột biến này chiếm... xác định đột biến mất đoạn gen ở mức độ mRNA của 80 bệnh nhân DMD và ông đã xác định được tỷ lệ mất đoạn gen Dystrophin chiếm 63% bệnh nhân được chẩn đoán DMD Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Prior (2005) đã phát hiện tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen Dystrophin là 60 ÷ 65% ở các bệnh nhân DMD Năm 2004, TS.BS Trần Vân Khánh đưa ra bảng tổng kết so sánh tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen trên bệnh nhân DMD... cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38% có đột biến xóa đoạn gen dystrophin - Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện 13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD - Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58 bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ xóa đoạn exon 46, 51 và cả... biến xóa đoạn kéo dài từ vùng tận 5’ đến vùng trung tâm của gen Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàn (2005) cho thấy 62,5% các đột biến mất đoạn của bệnh nhân DMD nằm ở vùng trung tâm (từ exon 42 đến exon 60) của gen Dystrophin và 21,9% đột biến gen xảy ra ở vùng tận 5’ (từ exon 1 đến exon 19) Năm 2002, Poh-San Lai đã tiến hành nghiên cứu, so sánh đột biến mất đoạn gen Dystrophin của các bệnh nhân DMD... Mỹ, châu Âu và châu Á; tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen Dystrophin dao động trong khoảng 33 ÷ 65%; tại châu Mỹ và châu Âu bệnh nhân DMD của Hoa Kỳ và Hy Lạp có tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen khá cao 60 ÷ 65%, tiếp sau là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhân DMD của Anh, thấp hơn là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhân DMD tại Đức, Argentina và Venezuela dao động từ 30% đến 40%; tại châu Á, bệnh nhân DMD ở Thái Lan, Ấn Độ,... 85 bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR ở mức độ DNA, với 19 cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại 19 exon thuộc hai vùng hotspot đã phát hiện được 32 trường hợp (chiếm tỉ lệ 38%) có đột biến mất đoạn gen; hầu hết các đột biến này đều tập trung ở vùng trung tâm của gen, chiếm tỉ lệ 66%; 22% trường hợp xuất hiện đột biến xóa đoạn ở vùng đầu tận 5’ và 4 bệnh nhân (chiếm tỉ lệ 12%) có đột biến. .. Lành bệnh lành lành mang bệnh gen bệnh D D D X Y lành X X 1 0 1 0 0 Lành XDY lành XDXd ½ ½ ½ 0 lành mang gen ½ bệnh XDY lành XdXd 0 1 0 1 0 bệnh XdY bệnh XDXD 1 0 0 1 0 Lành XdY bệnh XDXd ½ 0 ½ ½ lành mang gen ½ bệnh d X Y bệnh XdXd 0 1 0 0 1 bệnh Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ biểu hiện bệnh. .. VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Nhóm chứng (n=5): Gồm 2 người nam bình thường, tiền sử gia đình không có ai mắc bệnh di truyền Nhóm chứng được dùng như chứng dương bình thường để chạy MLPA cùng với mẫu bệnh nhân - Nhóm nghiên cứu: gồm 6 bệnh nhân được chẩn đoán bị mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne dựa vào một số triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình Bệnh nhân có tiền sử... Francke 1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen 16 17 17 có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt Có khoảng 30% bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ 1.4 Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin 1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới... Phòng bệnh DMD DMD là bệnh di truyền tiên lượng nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định rằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh DMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó là việc phát hiện người lành mang gen . Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne được thực hiệnnhằm mục tiêu: Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA 7 7 8 CHƯƠNG. đột biến xóa đoạn và lặp đoạn nhanh chóng, chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi. Với những ý nghĩa trên đề tài: Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh. biến xóa đoạn gen Dystrophin Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và đột biến điểm. Trong đó tỉ lệ các dạng đột biến: Đột biến xóa đoạn chiếm khoảng 60% Đột biến điểm