i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC    TỐNG THỊ MƠ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC    TỐNG THỊ MƠ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – VI SINH Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.MAI THỊ HẰNG Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Qua một thời gian làm việc và học tập tại Phòng thí nghiệm Bộ mô n Công nghệ Sinh học – Vi sinh tôi đã hoàn thành công trình: “Nghiên c ứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩmMultienzym từ nấm mốc và đánh giá độ an toàn của chúng dùng cho chăn nuôi” Để hoàn thành được công trình này, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đ ỡ , chỉ bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô, gia đình và các b ạn đồng n g h iệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Tiến sĩ Mai Thị Hằng, người đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập, người đã dìu dắt những bước đi đầu tiê n trong con đường khoa học và luôn sát cánh cùng tôi trong quá t r ì nh nghiên c ứu ! Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chi em bộ môn Vệ sinh Thú y, Viện Thú y trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm tại Viện! Tôi chân thành cảm ơn tất cả anh, chị em phòng Công nghệ Sinh học – Vi sinh đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian q ua ! Xin chân thành cảm ơ n ! Hà Nội, tháng 09 năm 2010 Tống Thị Mơ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU i 1. Lý do chọn đề tài 1 2.Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2 4. Nội dung của đề tài: 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1. Vai trò của enzyme trong chăn nuôi 4 1.1 Các enzyme tiêu hóa chủ yếu sử dụng trong chăn nuôi 4 1.1.1 a-Amylase 5 1.1.1.1. Đặc tính của enzym α-amylase 5 1.1.1.2. Cơ chế tác dộng của enzym α-amylase 7 1.1.2 Cellulase 9 1.1.2.1 Hệ enzyme phân giải cellulose 10 1.1.2.2. Endoglucanase (EC.3.2.1.4,b-Dglucan-glucanolhydrolase hay carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase) 10 1.1.2.3. Exoglucanase (EC.3.2.1.91. 1,4 b - glucan – celobiohydrolase 11 1.1.2.4. b-1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 b-1,4 glucosidase hay cellobiase): 11 1.1.2.5. Exoglucohydrolase (EC.3.2.1.74): 1,4 b -D glucan – glucohydrolase) 12 1.1.3. Xyl a nase 12 1.1.3.1. Cấu trúc hoá học của x y l a n 12 1.1.3.2. Hệ thống enzyme phân giải xylan và sự hình thành tổ h ợ p xylanase ở vi sinh vật 14 1.1.4. Phytase 16 1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng enzyme trong chăn nuôi 17 2. Các phương pháp lên men enzyme vi sinh vật 21 2.1. phương pháp lên men chìm 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii 2.2. Phương pháp lên men rắn 22 3. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp enzyme 23 3.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng 23 3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy 25 4. Tính an toàn của các chế phẩm enzyme từ Aspegillus 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1.Vật liệu 29 2.1.1.Chủng vi sinh vật 29 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 29 2.1.3. Hoá chất 29 2.1.4. Thiết bị 30 2.2. Phương pháp nghiên c ứu 30 2.2.1. Phương pháp vi si nh 30 2.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh amylase trên cơ chất bã sắn của chủng A. oryzae NM1 31 2.2.1.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 31 2.2.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ KNO 3 và KH 2 PO 4 lên khả năng sinh amylase 32 2.2.1.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 32 2.2.1.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của amylase 32 2.2.1.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của amylase 33 2.2.1.7 Ảnh hưởng của lượng giống (bào tử/g) ban đầu đến khả năng sinh amylase 33 2.3. Xác định ảnh hưởng của H 2 O 2 đến hoạt động của amylase 33 2.4. Phương pháp nghiên cứu enzyme 34 2.4.1. Xác định hoạt tinh một số loại enzyme thuỷ phân ngoại bào 34 3. Đánh giá độ an toàn của chế phẩm enzyme trên động vật 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 3.1 Đánh giá độ độc cấp tính 40 3.2. Đánh giá độc tính cấp khi sử dụng enzyme liều cao trong 7-14 ngày 43 3.3. Đánh giá độc tính chậm khi sử dụng enzyme liều cao trong 90 ngày 44 3.4. Tính toán và xử lý số liệu 44 3.5 Các phương pháp khác 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Ảnh hưởng các yếu tố dinh dưỡng đến sinh tổng hợp amylase 46 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh amylase trên cơ chất bã sắn của chủng A. oryzae NM1 46 3.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 48 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 49 3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh amylase 51 3.1.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh amylase 52 3.1.6. Ảnh hưởng của nồng độ KNO 3 và KH 2 PO 4 đến khả năng sinh amylase 53 3.1.7 Ảnh hưởng của số lượng bào tử ban đầu đến khả năng sinh amylase 54 3.2 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm amylase thô 56 3.3 Phối trộn enzyme thô từ chủng A. niger ĐB106 và enzyme thô từ chủng A. oryzae NM1 60 3.4. Đánh giá độ an toàn của chế phẩm enzyme multienzyme trên động vật 62 3.4.1.Đánh giá cấp độ độc cấp tính 62 a. Dị ứng da 62 b. Dị ứng mắt 63 c. Dị ứng đường thở 63 3.4.2 Đánh giá độc tính cấp chậm 14 ngày 64 3.4.3. Đánh giá độc tính 90 ngày 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 3.4.4. Kết quả kiểm tra mẫu máu: Kiểm tra tại Khoa huyết học của Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội (Bảng 3.4.4) 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 I. KẾT LUẬN 68 II. KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT T Ắ T CMC Carboxyl methyl cellulose CNSH Công nghệ sinh học Cs Cộng sự DNS Dinitro Salysilic IU International units KLPT Khối lượng phân tử OD Optical Density OSX Oat Spelt Xylan CTM Công thức máu RNM Rừng ngập mặn VSV Vi sinh vật RBC Hồng cầu WBC Bạch cầu PLT Tiểu cầu TN Thí nghiệm MT Môi trường MTCS Môi trường cơ sở DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii Hình 1 Cấu trúc hoá học của cellulose 9 Hình 2 Cấu trúc của xylan với các chuỗi bê n 14 Hình 3 Sơ đồ tác động của các loại enzyme thủy phân xylan trình bày tóm tắt 15 Hình 4 Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein 16 Hình 2.4 Đồ thị tinh bột chuẩn 35 Hình 2.5 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS 37 Hình 2.6 Đồ thị chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS) 39 Hình 3.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 49 Hình 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 50 Hình 3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh amylase 52 Hình 3.1.5 Ảnh hưởng của pH dịch khoáng ban đầu đến khả năng sinh amylase 53 Hình 3.2 Quy trình sản xuất chế phẩm amylase thô từ A. oryzae NM1 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... http://www.lrc-tnu.edu.vn xylan trong cỏc lo i c v cỏc th c v t m t n m ch y u l arabinoxylan Xylan d ng chu i khụng phõn nhỏnh c ng ó c tỡm th y trong c gi y (espato grass), cõy thu c lỏ v trong m t s t o n c m n Nh ng lo i xylan ny cú ch a uụi xylopyranosyl bao g m c liờn k t 1,3- v 1,4- -glucoside M c polyme hoỏ c a xylan c ng thay i, ch ng h n nh xylan c a g c ng cú ch a 150-200 g c -xylopyranosyl trong khi... ng70-130 [37] D a trờn thnh ph n cỏc nhúm th ph bi n m xylan cỏc lo i sau: xylan c phõn thnh n thu n m ch th ng, arabinoxylan, glucuronoxylan, v glucuronoarabinoxylan Ngay trong m i lo i xylan ny c ng cú m t s sai khỏc nh v m c v b n ch t c a nhỏnh bờn B khung chớnh v nhỏnh bờn c a xylan núi chung c th hi n hỡnh 2 nhi u th c v t m t ph n nh xylan l d ng axetyl húa (acetylate) Cỏc nhúm O-acetyl cú m t... vũng xylosyl S phõn c t hon ton cỏc acetylxylan b i cỏc xylanase l khú kh n, cú l l do s c n tr b i phõn b khụng gian c a cỏc phõn t ny cú th thu phõn hon ton cỏc acetylxylan c n s ph i h p tỏc acetylxylanesterase v cỏc endo-xylanase S cú m t c a m t l ng c a c ng nh cỏc axit feruloyl v pcoumaroyl liờn k t v i cỏc vũng -L- arabinose trong c u trỳc c a xylan c ng ó c thụng bỏo trong m t vi nghiờn c u... h p ph ng kh Quy c n thi t b c súng 540nm T giỏ tr OD ta tớnh c t o ra nh c: M t ng chu n ó xỏc nh c trờn n v ho t tớnh c a CMC-ase (IU) l l gi i phúng 1àmol nghi m, v i glucose l d i ch ng trong 5 phỳt, cho qua ng kh trong m t phỳt ng enzyme i u ki n thớ ng chu n c/Xỏc nh ho t tớnh Xylanase (Bailey v Cs, 1992) [19] Nguyờn lý: Xylanase (endo-xylanase 1,4- xylanase) phõn c t c ch t xylan thnh cỏc oligoxylose... ng 3.1.3 nh h ng c a th i gian lờn men lờn kh n ng sinh amylase Th i gian 20 24 28 32 36 40 Ho t tớnh IU/g 40,21 44,902 40,13 39,24 34,71 20,15 50 Hoạt tính (IU/g) 45 40 35 30 25 20 15 16 20 24 28 32 36 40 44 Thời gian Hỡnh 3.1.3 nh h ng c a th i gian lờn men n kh n ng sinh amylase K t qu cho th y th i gian t o ra enzyme c a ch ng ny (44,902IU/g) 24 gi N u kộo di th i gian enzyme gi m cựng v i s xu... arabinofuranosyl c a phõn cỏc arabinan, u ch a arabinoxylan v arabinogalactan c a cỏc nhúm bờn - a-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thu phõn cỏc liờn k t -1,2- glycosidic gi a xylose v axit D- glucuronic, k c cỏc liờn k t v i 4-Omethyl c a cỏc nhúm bờn - Cỏc acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6) b góy liờn k t gi a xylose v axit axetic c a cỏc nhúm bờn S tỏc ng c a cỏc lo i enzyme th y phõn xylan trỡnh by... i mụi tr ng, xylanase lm gi m l ng phõn khụ h n, gúp ph n gi m ụ nhi m mụi tr ng phõn ng [8] B sung xylanase lm t ng kh n ng tiờu hoỏ NSP t ng s ch n chớnh l ng c c b sung h n h p xylanase, ut ng B sung ch xylanase ho c -galactosidase, protease lm t ng s carbohydrate, protein v ch t bộo Khi nghiờn c u l n cú tiờu hoỏ l n cai s a giai o n s m c ng th y b sung xylanase cựng v i -glucanase v amylase lm... 1987) Tuy nhiờn, 1 th i gian di s d ng A niger nh 1 ngu n enzyme th c ph m, ó cú s l ng ỏng k cỏc nghiờn c u v an ton, gi ng nh cỏc bỏo cỏo khoa h c t i JECFA cho th y, s n ph m cú r t hi m g p Vỡ v y, JECFA ó xem xột l i quy t 1990 v thay i ADI cho tỏch ti n enzym t c nh c a mỡnh vo n m A niger thnh `` khụng c''(FAO /WHO, 1990) Ngoi m t ỏnh giỏ tớch c c c a JECFA, h u h t cỏc n c quy nh vi c s d ng enzym,...DANH M C B NG B ng B ng 2.4 Tờn b ng K t qu th c nghi m khi o OD b nh h ng c a ngu n tinh b t B ng 3.1.2 nh h ng c a B ng 3.1.3 nh h ng c a th i gian lờn men B ng 3.1.4 nh h ng c a nhi t B ng 3.1.5 nh h ng c a pH ban B ng 3.1.6 nh h ng c a n ng B ng 3.1.7 nh h ng c a s l B ng 3.2 B ng 3.3.1 B ng 3.3.2 B ng a B ng c n kh n ng sinh amylase m ban u 35 c súng 560nm B ng 3.1.1 ban Trang u u 47... xylan trong nhi u tr ng h p ó c ch ng minh Nh ng b ng ch ng v liờn k t ete gi a arabinose v lignin hay gi a axit glucuronic v i lignin c ng ó c cụng b Cỏc nhúm feruloyl c ng cú th hỡnh thnh liờn k t ngang gi a xylan v lignin Cỏc chu i b m t (nhúm th ) quy t nh kh n ng ho tan, c u trỳc v t lý v kh n ng ph n ng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn - - Arabinofuranosidase . NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC. TỐNG THỊ MƠ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – VI. gian làm việc và học tập tại Phòng thí nghiệm Bộ mô n Công nghệ Sinh học – Vi sinh tôi đã hoàn thành công trình: Nghiên c ứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩmMultienzym từ nấm mốc và đánh