Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MINH PHÚC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2 TRONG ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THỊ MINH PHÚC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2 TRONG ESCHERICHIA COLI Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN Hà Nội - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Lê Quang Huấn người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình ngay từ những bước đi đầu tiên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, dạy bảo tận tình của các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp trong phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ Sinh học. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo Trường Đại học Thái Nguyên; Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật và Viện Công nghệ Sinh học đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu. Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè tôi đã tạo mọi điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2010 Học viên Lê Thị Minh Phúc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined. Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined. 1. BỆNH UNG THƯ VÚ Error! Bookmark not defined. 1. 1. Giới thiệu chung về bệnh ung thư và ung thư vúError! Bookmark not defined. 1.2. Tình hình UTV trên thế giới và Việt Nam……………………………….… 2 1.3. Triệu chứng và bệnh sinh Error! Bookmark not defined. 1.4. Phân loại UTV Error! Bookmark not defined. 1.5. Điều trị Error! Bookmark not defined. 2. KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UTVError! Bookmark not defined. 2.1. Khái quát về gen HER2 và kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined. 2.2. Cấu trúc của HER2 Error! Bookmark not defined. 2.3. Mô hình cơ chế gây UTV của HER2 Error! Bookmark not defined. 2.4. Các nghiên cứu về đột biến trên HER2 Error! Bookmark not defined. 2.5. HER2 và UTV Error! Bookmark not defined. 3. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNGError! Bookmark not defined. 3.1. Cấu tạo chung của kháng thể (Immunoglobulin)Error! Bookmark not defined. 3.2. Kháng thể đơn dòng Error! Bookmark not defined. 3.3. Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể Error! Bookmark not defined. 4. KỸ THUẬT PHAGE DISPLAY Error! Bookmark not defined. 4.1. Giới thiệu chung Error! Bookmark not defined. 4.2. Thực khuẩn thể M13 Error! Bookmark not defined. 4.3. Tạo thư viện phage display Error! Bookmark not defined. 4.4. Sàng lọc với thư viện phage Error! Bookmark not defined. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5. CÁC HẠT NANO VÀNG VÀ ỨNG DỤNG Error! Bookmark not defined. 5.1. Tổng hợp các hạt nano vàng Error! Bookmark not defined. 5.2. Các ứng dụng của các hạt nano Error! Bookmark not defined. Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined. 1. VẬT LIỆU Error! Bookmark not defined. 1.1. Sinh phẩm Error! Bookmark not defined. 1.2. Mồi Error! Bookmark not defined. 1.3. Hóa chất và trang thiết bị Error! Bookmark not defined. 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined. 2.1. Các phương pháp thao tác với DNA Error! Bookmark not defined. 2.2. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined. 2.3. Các kỹ thuật phage display Error! Bookmark not defined. Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined. 1. KẾT QUẢ TẠO KHÁNG NGUYÊN HER2 TÁI TỔ HỢPError! Bookmark not defined. 1.1. Kết quả tách dòng gen mã hóa kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined. 1.2. Tách chiết DNA plasmid và xác định trình tự nucleotide gen HER2Error! Bookmark not defined. 1.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined. 1.4. Kết quả biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HER2Error! Bookmark not defined. 2. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG HER2Error! Bookmark not defined. 3. KẾT QUẢ TẠO THƢ VIỆN scFv VÀ CHỌN DÒNG scFv ĐẶC HIỆU HER2 Error! Bookmark not defined. 3.1. Kết quả thu nhận gen mã hóa scFv từ gà đặc hiệu HER2………………… 56 3.2. Kết quả tạo kháng thể phage đặc hiệu HER2 61 4. KẾT QUẢ GẮN KHÁNG THỂ VỚI HẠT VÀNG ĐỂ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN Error! Bookmark not defined. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4.1. Chức năng hóa về mặt sinh học của các hạt nano vàng bởi protein BSA……63 4.2. Kết quả xác định phổ hấp thụ của phức hệ kháng thể- vàng…………………65 KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined. KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined. PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined. THUẬT NGỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ 1 aa Amino acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Amp Ampicillin 2 AuNPs Gold Nanoparticles (Các hạt nano vàng) 3 bp Base pair (Cặp bazơnitơ) 4 ddNTP Dideoxynucleotide 5 dNTP Deoxynucleotide 6 DNA Acid deoxyribonucleic 7 EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid 8 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Thí nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme) 9 EtBr Ethidium Bromide 10 HRP Horseradish peroxidase 11 IPTG Isopropyl-  -D-Thiogalactopyranoside 12 Ka Kanamycin 13 Kb Kilo base pair 14 kDa Kilo Dalton 15 KTĐD Kháng thể đơn dòng 16 LB Môi trường Lauria Betani 17 NIR Near Infrared Region 18 NPs Nanoparticles 19 OD Optical Density (mật độ quang học) 20 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 21 PEG Polyethylen Glycol 22 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 23 TAE Tris - Acetate - EDTA 24 TE Tris - EDTA 25 UTV ung thư vú 26 v/p Vòng/phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 LỜI MỞ ĐẦU HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Cho đến nay, vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2 tuy nhiên nó có thể tạo dimer với bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ để hình thành đồng thụ thể (coreceptor) thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu. Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư vú. Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư. Đặc điểm này làm cho HER2 trở thành một marker hữu hiệu để chẩn đoán sớm ung thư cũng như đích tấn công của liệu pháp điều trị miễn dịch. Ung thư vú hiện nay đang là một trong hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất trong các bệnh ung thư ở nữ giới. Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh (non-targeted effect). Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị thấp. Những nghiên cứu gần đây về các chỉ thị sinh học trong ung thư vú đã mở ra một hướng điều trị mới, thông minh và đầy triển vọng, liệu pháp điều trị tấn công đích (targeted therapy), có thể loại bỏ gần như hoàn toàn nhược điểm của các liệu pháp truyền thống. Một trong số thuốc có bản chất kháng thể đặc hiệu HER2 đã được FDA chấp thuận để điều trị cho các bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 ở giai đoạn cuối là Herceptin. Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2 trong Escherichia coli”. Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào động vật – cụm phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BỆNH UNG THƢ VÚ 1. 1. Giới thiệu chung về bệnh ung thƣ và ung thƣ vú Ung thư là tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh gồm trên 200 loại khác nhau về nguồn gốc của tế bào, nguyên nhân gây bệnh và cách thức điều trị nhưng có những đặc điểm chung đó là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào, khả năng tồn tại và phát triển ở các cơ quan và tổ chức lạ [1,2,26]. Ung thư xảy ra như kết quả của các đột biến hay những thay đổi bất thường trong các gen chịu trách nhiệm cho việc điều hòa sự phát triển của các tế bào và giữ cho các tế bào luôn khỏe mạnh. Ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3 sau bệnh tim mạch và đột quỵ ở các nước phát triển và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 sau bệnh tim mạch ở Mỹ (http://www.cdc.gov). Những nghiên cứu đã thống kê là có khoảng 10 triệu ca mắc mới, 6 triệu ca tử vong và 22 triệu người chung sống với ung thư trên khắp thế giới năm 2000. Những con số này tương ứng với việc tăng tỷ lệ mắc và tử vong lên khoảng 22% so với những tỷ lệ này của năm 1990. Người ta ước lượng rằng con số các ca mắc ung thư mới trên khắp thế giới sẽ là 12.3 và 15.4 triệu người vào năm 2010 và 2020 theo thứ tự . Năm 2008, ước tính ở Mỹ có tổng số 1.437.180 ca ung thư mới và 565.650 ca tử vong. Ung thƣ vú Là một khối u ác tính được phát triển từ các tế bào vú. Thông thường UTV hoặc là khởi phát trong các tế bào có khả năng sản sinh sữa của tiểu thùy tuyến vú, hoặc là trong các ống dẫn sữa từ các tiểu thùy ra núm vú. Ít phổ biến hơn, UTV có thể khởi phát trong các mô đỡ nơi chứa các mô liên kết dạng sợi và các mô mỡ của vú. 1.2. Tình hình UTV trên thế giới và Việt Nam UTV trên thế giới UTV là một trong những ung thư thường thấy nhất ở nữ giới và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi. Ở các nước, tỷ lệ phụ nữ mắc UTV gia tăng đều đặn hằng năm, tính chung trên toàn thế giới UTV ở phái nữ được xếp vào hạng nguy cơ hàng đầu. Theo thống kê, tỉ lệ tử vong do UTV ở phụ nữ tại Nhật Bản, [...]... tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo ra vẫn bảo tồn hoạt tính nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích Không giống các kháng thể đơn dòng thường được tạo ra trong nuôi cấy tế bào động vật có vú, scFv thường được tạo ra trong nuôi cấy tế bào vi khuẩn như E .coli Hình 10 Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi 3.4 Kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị UTV Hiện nay trên thế... gắn kết với kháng nguyên Chuỗi nặng CH 1 Chuỗi nhẹ CL κ hoặc λ CH 2 Hoạt hoá bổ thể CH 3 μ, γ, δ, α hoặc ε Gắn đại thực bào COOCOO- Hình 9 Sơ đồ cấu tạo của kháng thể 3.2 Kháng thể đơn dòng Kháng thể đơn dòng là thuật ngữ chỉ các kháng thể thu nhận được từ một tập hợp các kháng thể đồng nhất với nhau về bản chất, nghĩa là kháng thể đơn dòng là tập Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17... tổ hợp các nhà khoa học đã nghiên cứu để tạo ra các kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đặc hiệu với HER2 giúp cho sự chẩn đoán và điều trị UTV mang lại hiệu quả cao hơn [33,37] Ở Việt Nam, các thuốc chữa ung thư có bản chất kháng thể đơn dòng cũng đã xuất hiện nhưng với giá thành rất cao, phạm vi áp dụng hẹp, không thể đáp ứng được nhu cầu chữa trị của bệnh nhân Do đó việc nghiên cứu và đưa vào sản xuất các... thư bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đang rất được quan tâm Dưới đây là một số loại kháng thể đang được sử dụng trong điều trị UTV dương tính với HER2 Herceptin Herceptin (còn được gọi là Trastuzumab) là một kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ DNA chuột, trực tiếp chống lại vùng ngoại bào (ECD) của thụ thể HER2 Cũng như các kháng thể đơn dòng kháng HER2, Herceptin là một phân tử kháng thể IgG1 của người với... trường hợp khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả thấp Các nhà khoa học của Genetech Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 http://www.lrc-tnu.edu.vn (Genetech, Inc 4817400, South San Francisco, CA 94080-4990) đã nghiên cứu và tạo ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu HER2 sử dụng trong điều trị UTV di căn có biểu hiện mạnh HER2 Hiện nay, sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp các... khoa học thì hợp chất này rất đặc hiệu với HER2, nhưng HER2 lại được biểu hiện ở một số mô gồm cả mô tim, vì vậy cũng cần nghiên cứu thêm để xác định chắc chắn về độ an toàn của hợp chất này khi sử dụng trên người Pertuzumab Pertuzumab (rhu mAb-2C4) là một loại kháng thể được tạo ra bởi hãng Genetech Pertuzumab liên kết với vùng nhị hợp của HER2 và bất hoạt quá trình nhị hợp của thụ thể HER2 với chính... tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn hợp các kháng thể đồng nhất cùng nhận biết và gắn kết với một epitope Ngược lại, các kháng thể đa dòng là tập hợp nhiều loại kháng thể không đồng nhất và nhận biết các epitope khác nhau 3.3 Kháng thể đơn chuỗi – Mảnh kháng thể Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) là một protein dung hợp của các vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL)... chức năng 2 KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UTV 2.1 Khái quát về gen HER2 và kháng nguyên HER2 Đặc điểm của các kháng nguyên trên bề mặt các tế bào ung thư là luôn luôn biến đổi để trốn tránh sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch, do đó việc chọn lựa phân tử biểu thị trên bề mặt làm chỉ thị cho tế bào ung thư là rất cần thiết Đối với mỗi dạng ung thư đều có một hoặc một vài kháng nguyên đặc trưng cho... bào của loài gặm nhấm giống HER2 đột HER2, ErbB2, c- Tế bào ErbB2 người HER2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên của 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn HER2V659E Đột biến gây biến dạng HER2 từ người, tương đồng với neu T C Không thấy trong tự nhiên HER2 Isoform của HER2 bị khuyết một exon B Thường tìm thấy trong isoform thứ cấp HER2YVMA Đột biến vùng kinase của HER2 và làm tăng hoạt tính... Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn kích hoạt gen đích hoạt động, phiên mã và dịch mã mà tế bào không kiểm soát được [49,60] 3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ KHÁNG THỂ - KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 3.1 Cấu tạo chung của kháng thể (Immunoglobulin) Kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn . thư vú dương tính với HER2 chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên HER2 trong Escherichia coli . Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào. SINH VẬT LÊ THỊ MINH PHÚC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN HER2 TRONG ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC . để phát triển và thực hiện chức năng. 2. KHÁNG NGUYÊN HER2 ĐẶC HIỆU TẾ BÀO UTV 2.1. Khái quát về gen HER2 và kháng nguyên HER2 Đặc điểm của các kháng nguyên trên bề mặt các tế bào ung thư là