BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGYỄN THỊ THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỨC ðỘ NHIỄM SALMONELLA TRÊN LỢN TẠI MỘT SỐ LÒ MỔ TRÊN ðỊA BÀN HÀ NỘI, BƯỚC ðẦU XÁC ðỊNH NGUYÊN NHÂN NHIỄM KHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGYỄN THỊ THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỨC ðỘ NHIỄM SALMONELLA TRÊN LỢN TẠI MỘT SỐ LÒ MỔ TRÊN ðỊA BÀN HÀ NỘI, BƯỚC ðẦU XÁC ðỊNH NGUYÊN NHÂN NHIỄM KHUẨN CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. PHẠM NGỌC THẠCH TS. NGUYỄN THỊ BÍCH THỦY HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi. Số liệu và kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa từng ñược sử dụng trong bất cứ luận văn, luận án nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thu Phương Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN! ðể hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, các thầy cô giáo trong Khoa Thú y, các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Nội chẩn – Dược – ðộc chất những người ñã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản và những ñịnh hướng ñúng ñắn trong học tập và tu dưỡng ñạo ñức, tạo tiền ñề tốt ñể tôi học tập, nghiên cứu và công tác. ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Ngọc Thạch – Giảng viên khoa Thú y – Người thầy giáo ñã dành nhiều thời gian và tâm huyết, tận tình hướng dẫn chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện ñề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn ñến tập thể Ban lãnh ñạo cơ quan Thú y vùng I, tập thể bộ môn Vệ sinh thú y – Viện thú y quốc gia, các anh chị em và bạn ñồng nghiệp ñã quan tâm tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, làm ñề tài và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, người thân và bạn bè ñã quan tâm giúp ñỡ, ñộng viên và tạo ñiều kiện cho tôi trong quá trình học tập, tiến hành nghiên cứu và hoàn thành ñề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 9 năm 2013 Học viên thực hiện Nguyễn Thị Thu Phương Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình viii MỞ ðẦU 1 Chương 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Nghiên cứu về thịt 4 1.1.1 Nguyên nhân gây hư hỏng thịt 4 1.1.2 ðường xâm nhập của vi khuẩn vào thịt 5 1.1.3 Các nguồn ô nhiễm vi khuẩn vào thịt 6 1.2 Tình hình ngộ ñộc thực phẩm 9 1.2.1 Khái niệm ngộ ñộc thực phẩm và bệnh truyền qua thực phẩm 9 1.2.2 Nguyên nhân gây ngộ ñộc thực phẩm 10 1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 16 1.4 Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella 18 1.4.1 ðặc ñiểm hình thái 18 1.4.2 Tính chất nuôi cấy 19 1.4.3 ðặc tính sinh hoá 20 1.4.4 Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella 20 1.4.5 ðặc ñiểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella 21 1.4.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella 22 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 1.4.7 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella 24 1.5 Một số nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella 30 1.6 Vệ sinh an toàn thực phẩm tại cơ sở giết mổ và chế biến thực phẩm 34 Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 39 2.1.1 ðối tượng nghiên cứu: 39 2.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 39 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 39 2.2 Nội dung nghiên cứu 39 2.2.1 Phân lập Salmonella: 39 2.2.2 Xác ñịnh mức ñộ nhiễm Salmonella trên mẫu lau thân thịt, mẫu lau sàn, mẫu lau dao thớt, mẫu nước và mẫu chất chứa manh tràng tại lò giết mổ 39 2.2.3 Xác ñịnh một số ñặc tính sinh vật hóa học và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn phân lập ñược. 40 2.2.4 Xác ñịnh nguyên nhân gây nhiễm và ñưa ra một số biện pháp khống chế chặn ñể ñảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 40 2.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 40 2.3.1 Mẫu thí nghiệm: 40 2.3.2 Các loại môi trường, hóa chất 40 2.3.3 Các loại kháng huyết thanh chuẩn ñể ñịnh typ vi khuẩn Salmonella 41 2.3.4 Các hóa chất, mồi và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR 41 2.3.5 Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm 42 2.4 Phương pháp nghiên cứu 42 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 42 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella 42 2.4.3 Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 43 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 2.4.4 Phương pháp xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược (Phương pháp ñịnh type Salmonella bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính ( theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kauffmann-White ) 44 2.4.5 Phương pháp xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh 48 2.4.6 Phương pháp xác ñịnh một số gen mã hóa tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng PCR 48 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 49 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Kết quả phân lập và xác ñịnh tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella từ các mẫu lấy từ lò giết mổ 50 3.1.1 Kết quả xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella từ mẫu lau thân thịt, lau sàn giết mổ, lau dao thớt, nước dùng giết mổ và mẫu chất chứa manh tràng 50 3.1.2 Tần suất chợ có mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella 55 3.2 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và ñặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella phân lập ñược 57 3.3 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 63 3.4 Kết quả kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 70 3.5 Kết quả xác ñịnh một số gen mã hóa tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 74 3.6 ðề xuất một số biện pháp khắc phục sự ô nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn quy mô nhỏ trên ñịa bàn Hà Nội 77 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 80 1 Kết luận 80 2 ðề nghị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BGA Briliant green agar BHI Brain heart infusion BPW Buffered peptone water CHO Chinese Hamster Ovary DPF Delayed Permeability Factor EMB Eosin Methylene Blue ETEC Enterotoxigenic E.coli GTP Guanosine triphosphate GDP Guanosine diphosphate LT Heat Labile Toxin MR Methyl red LPS Lipopolysaccharide PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis R Rough RPE Rated Perceived Exertion RPF Rapid Permeability Factor RV Rappaports Vassiliadis SS Salmonella shigella S Smooth ST Heat – stabile toxin TSI Triple sugar iron XLD Xylose lysine deoxycholate Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Kháng huyết thanh ức chế Kháng nguyên H pha 1 45 2.2 Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh 48 2.3 Trình tự các cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR tương ứng 49 3.1 Kết quả xác ñịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella từ các mẫu lấy tại 3 cơ sở giết mổ 51 3.2 So sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella giữa các cơ sở giết mổ trên ñịa bàn Hà Nội 54 3.3 Tần suất cơ sở giết mổ có mẫu dương tính với Salmonella 56 3.4 Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 58 3.5 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 62 3.6 Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella. 64 3.7 Tần suất xuất hiện của các serovar Salmonella tại các cơ sở giết mổ nghiên cứu 69 3.8 Kết quả kiểm tra khả năng kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập ñược 71 3.9 Tổng hợp khả năng kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập ñược 73 3.10 Kết quả xác ñịnh một số gen mã hóa tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập ñược 75 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Biểu ñồ so sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mẫu thí nghiệm 52 3.2 Biểu ñồ So sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella giữa các cơ sở giết mổ 54 3.3 Cấy chuyển sang MSRV 59 3.4 Cấy chuyển sang MK 59 3.5 Salmonella di ñộng trên MSRV 60 3.6 Salmonella trên XLT4 60 3.7 KL Salmonella trên Rambach 61 3.8 Kiểm tra trên Kligler 61 3.9 Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI 63 3.10 Tỷ lệ serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñối với lau thân thịt 65 3.11 Tỷ lệ serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñối với mẫu lau sàn giết mổ 65 3.12 Tỷ lệ serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñối với mẫu lau dao thớt 66 3.13 Tỷ lệ serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñối với mẫu nước dùng giết mổ 66 3.14 Tỷ lệ serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ñối với mẫu manh tràng 67 3.15 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Salmonellaphân lập ñược 73 3.16 Tỷ lệ gen kháng kháng sinh tetA, bla TEM của vi khuẩn Salmonella 75 3.17 Gen kháng kháng sinh với Ampicillin (bla TEM ) của vi khuẩn Salmonella 76 [...]... Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 2 vi c nghiên c u ñánh giá th c tr ng m c nhi m khu n Salmonella t i m t s cơ s gi t m trên ñ a bàn Th ñô và ñ xu t nh ng gi i pháp nh m ngăn ch n ñ b o ñ m VSATTP có ý nghĩa th c ti n quan tr ng ðây là lý do h c viên l a ch n ñ tài Nghiên c u m c ñ nhi m Salmonella trên l n t i m t s lò m trên ñ a bàn Hà N i , bư c ñ u xác ñ nh nguyên nhân nhi... u trúc kháng nguyên c a vi khu n Salmonella C u trúc kháng nguyên c a vi khu n Salmoenlla h t s c ph c t p, bao g m 3 lo i chính: Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên v * Kháng nguyên thân O (O- Antigen) Kháng nguyên O n m thành t bào vi khu n, có c u trúc Lipopolysaccharide (LPS) là thành ph n chính... m khu n” 2 M c tiêu nghiên c u - Phân l p và xác ñ nh m c ñ nhi m Salmonella spp t i m t s lò m trên ñ a bàn Hà N i - Xác ñ nh ñư c ñ c tính sinh v t hóa h c và kh năng kháng thu c c a vi khu n phân l p - Xác ñ nh ñư c m t s gen ñ c hi u c a Salmonella phân l p ñư c - ðưa ra m t s bi n pháp ngăn ch n s nhi m Salmonella ñ ñ m b o v sinh an toàn th c ph m Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th... i trên 7 tháng Trong xác súc v t ch t, Salmonella có th s ng trên 100 ngày, trong th t ư p mu i t 6-8 tháng (Nguy n Vĩnh Phư c và cs, 1970) 1.4.5 ð c ñi m d ch t h c c a vi khu n Salmonella Vi khu n Salmonella gây b nh cho ngư i và v t nuôi, phân b kh p nơi trên th gi i, vì v y các nghiên c u v cách truy n lây c a vi khu n này ñư c nhi u nhà khoa h c nghiên c u M t ñ c ñi m d ch t quan tr ng c a Salmonella. .. các b nh do Salmonella gây ra lúc ñ u ñư c ñ t tên chung là Phó thương hàn “Para-typhus”, cho ñ n năm 1914, có 12 loài vi khu n ñư c mô t và x p vào gi ng Salmonella Năm 1926, v i nh ng công trình nghiên c u c a White v c u trúc kháng nguyên c a Salmonella ñã b t ñ u m t th i kỳ khoa h c m i v gi ng vi khu n này Sau ñó Kauffmann cũng r t thành công trong lĩnh v c nghiên c u v vi khu n Salmonella (Selbizt... i quá trình nghiên c u chi ti t v vi khu n, các bi n pháp phòng b nh ñã ñư c nhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u, trong ñó có vacxin Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 17 phòng b nh Nguy n Văn Lãm (1968) ñã ti n hành nghiên c u ch vacxin Phó thương hàn l n con t ch ng Salmonella chu n c a Trung Qu c Hi n nay, các lo i vacxin phòng b nh Phó thương hàn ñã ñư c... (2002), kháng nguyên v ch có m t s loài như S typhi, S paratyphi S dublin cũng có th mang kháng nguyên v , kháng nguyên K có th làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác gi , n u ñun sôi huy n d ch c a các loài Salmonella này trong 10 ñ n 12 phút s phá Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 23 h y ñư c kháng nguyên v Kháng nguyên v là m t lo i kháng nguyên có kh... kháng th O khi phát tri n nhi u Kháng nguyên này ch g p 2 serotyp là: S typhi và S paratyphi C, ký hi u kháng nguyên hay Vi trong công th c ñ ng sau kháng nguyên O Theo sơ ñ c a Kauffmann – White; công th c kháng nguyên c a S paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S Typhi là: 9, 12, Vi: c,d Trong 3 kháng nguyên ch y u trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là 2 lo i kháng nguyên có ý nghĩa quan tr ng trong... th c bào c a ñ i th c bào (Morris và cs, 1976) Kháng nguyên O khích thích các cơ quan ñáp ng mi n d ch hình thành kháng th ñ c hi u ngưng k t v i kháng nguyên tương ng Cơ ch phòng v này giúp cơ th v t ch ch ng l i quá trình tái xâm nh p c a vi khu n ð n nay, ngư i ta ñã xác ñ nh ñư c trên 3000 serotyp kháng nguyên O c a Salmonella, thành ph n kháng nguyên c a vi khu n S choleraesuis g m: O6, O7; S typhimurium... t gây b nh c a vi khu n Salmonella 1.4.7.1 Các y u t không ph i là ñ c t a) Kháng nguyên O Ch t lư ng thành ph n hóa h c, c u trúc kháng nguyên O ñ u nh hư ng t i ñ c l c c a vi khu n Salmonella C th là: S typhimurium n u thay ñ i thành ph n kháng nguyên t công th c 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khu n t d ng có ñ c l c chuy n sang d ng không có ñ c l c (Valtonen, 1977) Kháng nguyên O là y u t ñ c l . Nghiên cứu mức ñộ nhiễm Salmonella trên lợn tại một số lò mổ trên ñịa bàn Hà Nội , bước ñầu xác ñịnh nguyên nhân nhiễm khuẩn . 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và xác ñịnh mức ñộ nhiễm Salmonella. NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGYỄN THỊ THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỨC ðỘ NHIỄM SALMONELLA TRÊN LỢN TẠI MỘT SỐ LÒ MỔ TRÊN ðỊA BÀN HÀ NỘI, BƯỚC ðẦU XÁC ðỊNH NGUYÊN NHÂN NHIỄM KHUẨN LUẬN. HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGYỄN THỊ THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỨC ðỘ NHIỄM SALMONELLA TRÊN LỢN TẠI MỘT SỐ LÒ MỔ TRÊN ðỊA BÀN HÀ