BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN HỒNG ÁNH NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ CHO GIỐNG CÀ CHUA DM166 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN HỒNG ÁNH NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ CHO GIỐNG CÀ CHUA DM166 CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH 2. TS. ðẶNG THỊ VÂN HÀ NỘI – 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước ñây. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn ñược sử dụng trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc, ñảm bảo trích dẫn theo ñúng quy ñịnh. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam ñoan này ! Tác giả Nguyễn Hồng Ánh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch Bộ môn CNSH- Trường ðH Nông nghiệp Hà Nội và TS. ðặng Thị Vân- Bộ môn CNSH, Viện Nghiên cứu Rau Quả Việt Nam ñã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin ñược gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học –Trường ðH Nông Lâm Bắc Giang ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình cùng bạn bè, những người ñã luôn quan tâm ủng hộ và là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian em làm luận văn này. Xin trân trọng cám ơn! Bắc Giang, ngày 22 tháng 8 năm 2013 Học viên Nguyễn Hồng Ánh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix MỞ ðẦU 1 1 ðặt vấn ñề 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Yêu cầu 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Vài nét về cà chua 3 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây cà chua 3 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng. 3 1.1.3 Giá trị kinh tế 4 1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua trên thế giới 5 1.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới 5 1.2.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trên thế giới 7 1.3 Tình hình sản xuất và nghiên cứu cà chua tại Việt Nam 11 1.3.1 Tình hình sản xuất cà chua tại Việt Nam 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam 12 1.4 Thực trạng nhiễm bệnh xoăn vàng lá ở cà chua 15 1.5 Một số nghiên cứu ứng dụng RNAi trong tạo giống cây chuyển gen 17 1.5.1 Trên thế giới 17 1.5.2 Ở Việt Nam 18 1.6 Cơ chế ñề kháng vi rút của cây cà chua chuyển gen 19 1.7 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 21 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 1.7.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 21 1.7.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 21 1.7.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA 22 1.7.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 23 1.7.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật 24 1.7.6 Các phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 26 1.8 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 28 1.8.1 Vector nhị thể 28 1.8.2 Hệ vector liên hợp 29 1.9 Các phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen ngoại lai trong cây chuyển gen 30 1.9.1 Kiểm tra sự hiện diện của gen ngoại lai 30 1.9.2 Kiểm tra ở mức ñộ phiên mã 33 1.9.3 Kiểm tra ở mức ñộ dịch mã 34 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 36 2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phát hiện cây chuyển gen bằng PCR 40 2.3.2 Chọn lọc cây chuyển gen ñộc lập bằng kỹ thuật Southern 42 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THAỎ LUẬN 46 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ các loại vật liệu khác nhau 46 3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá mầm 46 3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ thân mầm 47 3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá trưởng thành 48 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi 3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ñến khả năng tái sinh chồi từ callus 50 3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin và IAA ñến sự ra rễ của chồi cây cà chua nuôi cấy mô. 52 3.3 Kết quả ñánh giá sự ổn ñịnh ñộ bội của thể tái sinh 53 3.4 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào giống cà chua DM166 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 55 3.4.1 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn (OD 600nm ) ñến tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen Gus 55 3.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen Gus 57 3.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới hiệu quả chuyển gen 58 3.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trong quá trình ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 59 3.4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường lây nhiễm và trong môi trường ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 60 3.4.6 Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM166 60 3.5 Phân tích và ñánh giá cây chuyển gen 61 3.5.1 Tách DNA từ lá cây cà chua chuyển gen 62 3.5.2 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng PCR 62 3.5.3 Kết quả chọn lọc cây cà chua chuyển gen bằng lai Southern 66 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 1 Kết luận 70 2 Kiến nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 75 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) DNA : Deoxiribonucleic Acid FAO : Food and Agriculture Organization Gus : β-1,4-Glucuronidase IAA : β – Indol acid acetic NAA : Napthalene acetic acid PCR : Polymerase Chain Reaction Ti-plasmid : Tumor-Plasmid T-DNA : Transfer-DNA Vir : virulence Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Thành phần quả cà chua (trong 100g ăn ñược) 4 1.2 Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua của các châu lục trên thế giới năm 2011 6 1.3 Những nước có sản lượng cà chua cao nhất năm 2010 6 1.4 Những nước có giá trị nhập khẩu cà chua lớn nhất thế giới năm 2008 7 1.5 Diện tích, năng suất, sản lượng cà chua của Việt Nam 11 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 36 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá mầm 46 3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ thân mầm (sau 4 tuần nuôi cấy). 47 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Zeatin: IAA tới sự tạo thành Callus từ lá trưởng thành (sau 4 tuần nuôi cấy) 49 3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp Zeatin và IAA ñến khả năng tái sinh chồi từ callus (theo dõi sau 6 tuần). 51 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ Zeatin và IAA ñến hiệu quả ra rễ 53 3.6 ðánh giá ñặc ñiểm hình thái và mức bội thể của cây tái sinh trước khi ra vườn ươm 54 3.7 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tần số biểu hiện tạm thời của gen Gus ở giống cà chua DM166. 56 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng AS (Acetosyringone) ñến sự biểu hiện tạm thời của gen Gus. 57 3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới hiệu quả chuyển gen 58 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ trong quá trình ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 59 3.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường lây nhiễm và trong môi trường ñồng nuôi cấy tới hiệu quả chuyển gen 60 3.12 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng PCR 64 3.13 Kết quả lai Southern với mẫu dò 35S 68 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Bản ñồ Ti-plasmid dạng octopin 22 1.2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển T - DNA 25 1.3 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp 30 3.1 ðồ thị ñánh giá ảnh hưởng của sự phối hợp nồng ñộ IAA và Zeatin tới khả năng tạo callus ñối với lá mầm, thân mầm và lá trưởng thành 50 3.2 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm ADN tổng số 62 3.3 Kết quả ñiện di kiểm tra sự hiện diện promoter 35S của một số mẫu cà chua chuyển gen 63 3.4 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm khuyếch ñại trình tự mục tiêu của một số mẫu cà chua chuyển gen 63 3.5 Hình ảnh ñiện di kiểm tra sản phẩm enzyme cắt giới hạn 66 3.6 Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một số dòng cà chua chuyển gen 67 3.7 Hình ảnh hiển thị kết quả lai Southern mẫu dò cho promoter 35S của một số dòng cà chua chuyển gen 67 [...]... FM372C và áp d ng có hi u qu Vi c nghiên c u qui trình chuy n gen cho hai gi ng cà chua còn l i DM166 và M88 là c n thi t Trên cơ s quy trình chuy n gen c a gi ng FM372C chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài:“ Nghiên c u hoàn thi n quy trình chuy n gen cho gi ng cà chua DM166. ’’ 2 M c tiêu nghiên c u Nghiên c u nh m xác ñ nh ñư c quy trình chuy n gen phù h p cho gi ng DM166 3 Yêu c u - Thi t l p ñư c... pháp chuy n gen ñã ñư c phát tri n thành gi ng thương m i Tuy nhiên, k t qu các nghiên c u ñã ch ra r ng hi u qu chuy n gen vào cây cà chua ph thu c r t nhi u vào gi ng (genotyp dependent).ð tài: Nghiên c u ng d ng k thu t chuy n gen trong t o gi ng kháng virus xoăn vàng cà chua cho Vi t Nam ñư c ti n hành trên m t s gi ng (FM372C, DM166, M88).Trong ñó ñã xây d ng ñư c quy trình chuy n gen cho gi ng... ng ñ t o gi ng kháng b nh xoăn vàng lá ñã g p nhi u tr ng i do h n ch v ngu n gen, gen kháng TYLCV ch xu t hi n các lo i cà chua d i thêm n a tính tr ng kháng TYLCV thông thư ng ñư c quy t ñ nh ña gen nên vi c lai t o truy n th ng g p r t nhi u khó khăn ð c bi t b nh xoăn vàng lá ñư c coi là b nh ph c, tri u ch ng b nh xoăn vàng lá do nhi u lo i vi rút thu c chi Begomovirus, h Geminivirus gây ra [27]... y (thân m m, lá m m, lá trư ng thành) khác nhau c a gi ng DM166 - ðánh giá ñư c m c n ñ nh di truy n c a cây in vitro tái sinh t 3 lo i v t li u nuôi c y - Xác ñ nh ñư c các thông s cơ b n ñ hoàn thi n quy trình chuy n gen cho gi ng DM166 4 Ý nghĩa khoa h c K t qu nghiên c u là cơ s khoa h c cho các giai ño n nghiên c u khoa h c ti p theo trong vi c t o dòng cà chua kháng b nh xoăn vàng lá 5 Ý nghĩa... dùng cà chua ngày càng cao và tính ch t c nh tranh v i các gi ng ngo i nh p ngày càng kh c li t, các nghiên c u v t o gi ng cà chua lai trong nư c c n ñư c ñ y m nh ñ ti p t c ñưa ra các gi ng m i ph c v s n xu t 1.4 Th c tr ng nhi m b nh xoăn vàng lá cà chua B nh xoăn vàng lá do vi rút gây ra và gây h i trên nhi u cây tr ng khác nhau trong ñó có nhóm cây rau b thi t h i nghiêm tr ng nh t là cà chua. .. là b nh héo xanh (do vi khu n Ralstonia solanacearum) và b nh xoăn vàng lá ( do tomato yellow leaf curl virus - TYLCV thu c chi Begomovirus, h Geminiviridae) ð c bi t trong nh ng năm g n ñây, b nh xoăn vàng lá ñã gây ra nh ng thi t h i nghiêm tr ng trên v cà chua thu ñông s m và cà chua xuân hè Cây cà chua b b nh vi rút xoăn ng n s làm cho hoa và n b r ng nhi u, qu x p, khô nư c ph m ch t kém, năng... p t c nh ng công trình nghiên c u v ch n t o gi ng cà chua ñ ñáp ng nhu c u c a con ngư i ñ c bi t là cà chua qu nh ph c v ăn tươi và ch bi n 1.3 Tình hình s n xu t và nghiên c u cà chua t i Vi t Nam 1.3.1 Tình hình s n xu t cà chua t i Vi t Nam Cà chua là cây ñư c du nh p vào Vi t Nam m i ñư c hơn 100 năm nhưng ñã tr thành m t lo i rau ph bi n và ñư c s d ng ngày càng r ng rãi Cà chua nư c ta ñư c... nh xoăn vàng lá khác nhau (Vũ Văn H i, Hà Vi t Cư ng,2007) [22] Vi c tìm ki m m t gi i pháp h p lý ñ t o ñư c gi ng kháng ña vi rút gây b nh xoăn vàng lá cà chua là h t s c c n thi t B nh xoăn vàng lá không nh ng gây thi t h i h i n ng h u h t Vi t Nam mà nó còn gây thi t kh p các nư c trên th gi i B nh h i cà chua do TYLCV gây ra ñư c phát hi n ñ u tiên gây nh hư ng nghiêm tr ng t i s n xu t cà chua. .. vòng (papaya ringspot virus) ; bí ñao chuy n gen kháng ba lo i vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, t và cà chua chuy n gen kháng Cucumber mosaic virus 1.5.2 Vi t Nam Vi t Nam nghiên c u ng d ng k thu t chuy n gen RNAi ñ t o gi ng cây tr ng kháng b nh vi rút t năm 2007-2008 b i Lê Tr n Bình và c ng s v i ñ tài:” T o cây tr ng chuy n gen kháng b nh vi rút b... vài trăm dòng thu c lá chuy n gen kháng vi rút kh m dưa chu t (CMV), kháng vi rút kh m thu c lá (TMV) và kháng c 2 lo i vi rút trên Ki m tra tính kháng vi rút b ng gây b nh nhân t o th h To thu ñư c có t l kháng (s dòng kháng hoàn toàn/s dòng ki m tra) vi rút CMV là 70,9%, TMV là 74,5% và kháng c hai lo i CMV và TMV là 70,8% Công trình này cũng ñưa ra quy trình t o cây thu c lá kháng vi rút thành công . hiện ñề tài:“ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM166. ’’ 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu nhằm xác ñịnh ñược quy trình chuyển gen phù hợp cho giống DM166. 3. Yêu. tới hiệu quả chuyển gen 60 3.4.6 Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống cà chua DM166 60 3.5 Phân tích và ñánh giá cây chuyển gen 61 3.5.1 Tách DNA từ lá cây cà chua chuyển gen 62 3.5.2. trình chuyển gen cho giống FM372C và áp dụng có hiệu quả.Việc nghiên cứu qui trình chuyển gen cho hai giống cà chua còn lại DM166 và M88 là cần thiết Trên cơ sở quy trình chuyển gen của giống