Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 0 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          NGUYỄN THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA CHÍN CHẬM, KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SỸ HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          NGUYỄN THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA CHÍN CHẬM, KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp này là khách quan, trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong khóa luận đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Lan Anh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những người thân trong gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Kỹ sư Khúc Ngọc Tuyên và toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng - Khoa công nghệ sinh học - ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã rất nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết để có thể thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, anh em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Lan Anh Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC Lời cam ðoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục từ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích, yêu cầu 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Nguồn gốc, phân loại 3 2.1.1 Nguồn gốc 3 2.1.2 Phân loại 3 2.2 Giá trị và yêu cầu ngoại cảnh của cây cà chua 4 2.2.1 Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế của cây cà chua 4 2.2.2 Yêu cầu ngoại cảnh của cây cà chua 5 2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá 7 2.3.1 Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá 7 2.3.2 Nghiên cứu về nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá 7 2.3.3 Lập bản đồ và phát triển các chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng TYLCV 10 2.3.4 Đánh giá các nguồn gen kháng ở các vùng địa lý 14 2.3.5 Cơ chế tạo tính kháng TYLCV 15 2.4 Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín chậm 16 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 2.4.1 Quá trình chín của quả cà chua 16 2.4.2 Ethylene và vai trò trong quá trình chín của quả 17 2.4.3 Các dạng đột biến chín chậm ở cà chua 19 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 23 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23 3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 24 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24 3.3.1 Phương pháp đánh giá các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả 24 3.3.2 Đánh giá khả năng kháng TYLCV ở các THL triển vọng 27 3.3.3 Đánh giá tính chín chậm ở các THL triển vọng 28 3.3.4 PCR xác định gen chín chậm rin và gen kháng virus Ty3 28 3.4 Xử lý số liệu 29 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết quả đánh giá các tổ hợp lai vụ đông 2012 30 4.1.1 Kiểu hình sinh trưởng 30 4.1.2 Thời gian các giai đoạn sinh trưởng 31 4.1.3 Kết quả đánh giá một số đặc điểm hình thái và cấu trúc cây 33 4.1.4 Kết quả đánh giá về cấu trúc chùm hoa, đặc điểm nở hoa và tỷ lệ đậu quả 35 4.1.5 Kết quả đánh giá về năng suất và các yêu tố cấu thành năng suất 37 4.1.6 Kết quả đánh giá các đặc điểm hình thái và chất lượng quả 40 4.1.7 Giới thiệu các tổ hợp lai triển vọng 44 4.1.8 Ghép lây nhiễm đánh giá khả năng kháng TYLCV của các THL triển vọng 47 4.2 Kết quả PCR xác định các tổ hợp lai 48 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi 4.3 Chọn lọc cá thể cà chua tốt mang gen Ty3/Ty3 từ một số quần thể phân ly F2 50 4.3.1 PCR xác định cá thể mang kiểu gen kháng Ty3/Ty3 từ 4 quần thể phân ly F2 51 4.3.2 Chọn lọc các cá thể tốt từ các quần thể phân ly F2 dựa vào các đặc điểm nông sinh học 52 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ AVRDC Trung tâm nghiên cứu phát triển giống rau thế giới CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequences DNA Deoxyribo Nucleic Acid FAO Food and Agriculture Organization MAS Marker asissted selection NSCT Năng suất cá thể PCR Polymerase Chain Reaction SCAR Sequenced Characterized Amplified Region THL Tổ hợp lai TYLCV Tomato Yellow Leaf Curl Virus TYLCD Tomato Yellow Leaf Curl Disease Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC BẢNG STT Tên hình Trang 3.1 Các tổ hợp lai F1 chín chậm và kháng virus sử dụng trong nghiên cứu 23 4.1 Kết quả ðánh giá kiểu hình sinh trýởng, các giai ðoạn sinh trýởng và một số ðặc ðiểm hình thái cấu trúc cây của các tổ hợp lai F1 vụ ðông 2012 32 4.2 Ðặc ðiểm nở hoa, cấu trúc chùm hoa và tỷ lệ ðậu quả của các THL 36 4.3 Kết quả ðánh giá về nãng suất và các yêu tố cấu thành nãng suất của các THL 39 4.4 Kết quả ðánh giá một số ðặc ðiểm hình thái quả của các THL 42 4.5 Kết quả ðánh giá một số ðặc ðiểm chất lýợng quả của các THL 43 4.6 Một số ðặc ðiểm nông sinh học chính của các THL triển vọng 46 4.7 Phản ứng của các THL triển vọng với 3 nguồn virus xoãn vàng lá 47 4.8 Các cá thể mang gen Ty3/Ty3 ðýợc chọn từ 4 quần thể phân ly F2 sử dụng cặp mồi PCR P6-25 F2/R5 52 4.9 Ðặc ðiểm của 8 cá thể tốt mang gen kháng virus Ty3 ðồng hợp tử chọn ðýợc từ 4 quần thể phân ly trong vụ xuân hè 2013 53 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11 11 2.2 Bản ðồ gen Ty-5 trên nhiễm sắc thể 4 11 2.3 Bản ðồ gen Ty3 trên nhiễm sắc thể số 6 12 2.4 Bản ðồ gen Ty-4 trên nhiễm sắc thể số 3 12 2.5 Tác ðộng của LeMADS-RIN ðến quá trình sinh tổng hợp ethylen 17 2.6 Bản ðồ di truyền và vị trí của gen rin trên NST số 5 20 2.7 Bản ðồ di truyền và vị trí của gen nor trên NST số 10 20 2.8 Thời gian tồn trữ dài của con lai alc × ‘Vaibhav’ so với các dòng bố mẹ ở 25 o C 21 3.1 Các ðiểm kháng nhiễm bệnh xoãn vàng lá theo triệu chứng 28 4.1 Hình ảnh mô tả các dạng lá cà chua 34 4.2 Các dạng quả cà chua 41 4.3 Hình ảnh một số tổ hợp lai triển vọng kháng virus xoãn vàng lá 45 4.4 Ðánh giá tính kháng của các tổ hợp lai triển vọng 48 4.5 Kết quả PCR xác ðịnh các tổ hợp lai thật kháng virus sử dụng cặp mồi P6-25 F2/R5 phát hiện gen Ty3 49 4.6 Kết quả PCR phát hiện các tổ hợp lai chín chậm thông qua sự có mặt của gen chín chậm rin 49 4.7 Ðánh số chọn lọc cá thể từ các quần thể phân ly F2 ở giai ðoạn cây con 50 4.8 Kết quả PCR xác ðịnh cá thể mang gen kháng Ty3 ðồng hợp tử trong quần thể phân ly F2 của tổ hợp T1 sử dụng cặp mồi P6-25 F2/R5 51 [...]... tài: Nghiên c u ch n t o gi ng cà chua chín ch m, kháng virus xoăn vàng lá b ng ch th phân t DNA 1.2 M c ñích, yêu c u 1.2.1 M c ñích - ðánh giá, tuy n ch n m t s t h p lai (THL) F1 có kh năng chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá, có năng su t cao, ch t lư ng t t ñ ñưa vào s n xu t - Ch n l c trong m t s qu n th phân ly F2 các cá th t t mang gen chín ch m rin và gen kháng virus xoăn vàng lá Ty3... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 V t li u, ñ a ñi m và th i gian nghiên c u 3.1.1 V t li u nghiên c u – 28 t h p cà chua lai ch a gen chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá ñư c cung c p t trư ng ð i h c University of California Davis.(b ng 3.1), trong ñó: + 20 t h p cà chua lai kháng virus xoăn vàng lá v i gen kháng Ty3 t dòng b 192 (ki u gen Ty3/Ty3) + 8 t h p cà chua lai chín ch m v i gen chín ch m rin... th phân t DNA liên k t ch t v i các gen Ty1, Ty2, Ty3 và c gen chín ch m rin (Castro và c ng s , 2007a; Garcia và c ng s , 2007; Ji và c ng s , 2007a; Xiaoli, 2010) ñi u này giúp công tác ch n t o gi ng cà chua chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá b ng ch th phân t DNA ñư c tr nên d dàng hơn Vì nh ng lý do trên, v i m c ñích nghiên c u ch n t o gi ng cà chua chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá ph... n v ng – Ghép lây nhi m ñánh giá kh năng kháng virus xoăn vàng lá c a các t h p tri n v ng trong v xuân hè 2013 – Ki m tra di truy n ki u gen chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá các con lai F1 b ng ch th DNA – S d ng ch th phân t DNA ch n l c các cá th t t mang gen kháng virus xoăn vàng lá Ty3 m t s qu n th F2 tri n v ng trong v xuân hè 2013 3.3 Phương pháp nghiên c u 3.3.1 Phương pháp ñánh giá các... leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) (Green và c ng s , 2001), Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV), Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) (Ha và c ng s , 2011) và Tomato leaf curl Dan Xa virus (ToLCDXV) (Blawid và c ng s , 2008) 2.3.2 Nghiên c u v ngu n gen kháng virus xoăn vàng lá Loài cà chua tr ng (Solanum lycopersicum) c c kỳ m n c m v i virus xoăn vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV)... t o gi ng cà chua kháng virus xoăn vàng lá 2.3.1 Nguyên nhân gây b nh xoăn vàng lá B nh xoăn vàng lá cà chua l n ñ u tiên ñư c xác ñ nh t i Israel vào năm 1930 và hi n nay ñã ñư c xác ñ nh do m t nhóm các loài begomovirus khác nhau thu c h geminivirus gây ra, ñư c lan truy n b i vector b ph n tr ng (bemisa tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn (Hà Vi t Cư ng, 2008) M c dù nhóm geminivirus này bao g m... ng h p t b ng ch th DNA ñ gây t o dòng, gi ng cà chua thu n chín ch m và kháng virus xoăn vàng lá 1.2.2 Yêu c u - S d ng ch th phân t liên k t v i các gene m c tiêu (rin, Ty3) ñ ki m tra các t h p lai nh m lo i b các t h p lai gi - Ghép lây nhi m ñánh giá kh năng kháng virus c a các THL kháng virus tri n v ng và ñánh giá kh năng chín ch m trong v xuân hè 2013 - T o ñư c qu n th Phân ly F2 t các THL... ng ssDNA virus trong c ký ch kháng và m n c m, ñi u này là phù h p v i vai trò c a dsDNA virus như m t d ng trung gian c a ssDNA trong sao chép begomovirus dsDNA r t c n thi t khi begomovirus xâm nh p vào các t bào th c v t, ssDNA virus ñóng vai trò như khuôn ñ t ng h p d ng trung gian dsDNA Trong giai ño n th hai c a chu kỳ sao chép, dsDNA v a ñư c t ng h p l i v a là khuôn ñ t ng h p ssDNA virus. .. (bipartite begomovirus) và b i s khác bi t trong chu i DNA- A (Pena và c ng s , 2010) Các loài begomovirus b gen kép (bipartite genome) g m hai phân t DNA s i vòng ñơn: DNA- A (2,6-2,8 kb) và DNA- B (2,5-2,8 kb) (Gronenborn, 2007), các loài có b gen ñơn tương ñương phân t DNA- A Vi t Nam ñã phát hi n có 6 loài begomovirus gây ra b nh xoăn vàng ng n cà chua là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), Tomato... g i chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus (Vidavski, 2007) TYLCVD cho ñ n nay ñư c bi t có liên quan t i ít nh t 11 loài và hơn 25 ch ng monopartite begomoviruses (Fauquet và c ng s , 2008) B nh virus xoăn lá cà chua (Tomato leaf curl virus disease - ToLCVD) có nh ng tri u ch ng khác r t nh v i TYLCVD, nó ñư c chú ý sau này do ñư c gây ra b i các loài begomovirus b gen . tác chọn tạo giống cà chua chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA được trở nên dễ dàng hơn. Vì những lý do trên, với mục đích nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín. chậm và kháng virus xoăn vàng lá phục vụ cho sản xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín chậm, kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA . 1.2 cây cà chua 5 2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá 7 2.3.1 Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá 7 2.3.2 Nghiên cứu về nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá 7