1 M U t v Nghiên cu bn cht tính chng chu ca cây trng cho thy t tính tr th ca tng gen riêng r liên n tính chng chu  thc vt (ví d c nhiu nghiên cu tìm hiu và phân tích. Dng ca các yu t bt li t ngoi cnh, không ch các gen riêng r c biu hin mà là mt h thc kích hot biu hin nh ng vi tình trng bt li mà thc vt gp phi. Mt trong s nhng yu t kích hot hong ca các gen liên n kh ng chu là các nhân t phiên mã (transcription factor  TF).  NAC  TF   . NAC TF có  ng  .   khác nhau     Nhiu tác gi  nghiên cu chuyn gen mã hóa NAC TF thành công vào mt s loài cây tr, thuc lá cây lc, các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3   thành công, AhNAC2  Arabidopsis. Lc là cây nông nghip ngc trng ph bin trên th gii.  c ta, cây lc trng trên khp các min và phù hp vi nhiu vùng sinh thái khác nhau. Cây lc là cây h u, thuc nhóm chu hn kém. Vì vy, nu ci thic kh ng chu s m rc dit cây 2 trng. Mt s k thut chn to ging có kh u h ging hoc ng dng công ngh t bào thc vc áp dng. Tuy nhiên, vic s dng k thut chuyn gen nhm to ra nhng ging lc có kh u khô hc nghiên cu nhiu. T nh          tài: Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea nhm th nghim kh n gen ch th và tin ti chuyn gen chu hn  to ra dòng cây chuyn gen phc v chn ging chu hn  cây lc. ng dng thc tin ca nghiên cu nhm ci to cây lc và phá v hn ch v kh  chng chu ng cây trng này. 2. Mc tiêu nghiên cu (1) Phân lp c gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 t ging lc chu hn tt. (2) Thit k c vector cha cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2. To cây chuyn gen và biu hic protein NAC2  cây thuc lá. (3) Tc dòng cây lc chuyn gen. Phân tích các dòng cây lc chuyn gen. 3. Ni dung nghiên cu (1) Phân nhóm các ging lc nghiên cu theo m chu hn  u hn mô so và cây non. (2) Phân lp, tách dòng và gii trình t gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 n tính chu hn ca cây lc. (3) Thit k vector cha cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2, to vi khun A.tumefaciens mang vector tái t hp và chuyn vào cây thuc lá mô hình. 3 (4) nh s có mt ca gen chuyn NAC2 trên cây thuc lá,  u hn ca các dòng thuc lá chuyn gen thông qua s ng proline. Phân tích biu hin protein tái t hp NAC2  cây thuc lá chuyn gen. (5) Phát trin h thng tái sinh cây  cây lc và chuyn gen ch th (GUS) qua mô so và phôi soma. (6) Chuyn cu trúc gen NAC2 vào cây lc, phân tích các dòng lc chuyn gen. 4. Nhi ca lun án i) Tách dòng thành công gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 t ging lc chu hn tt L12. ii) Thit k thành công vector cha cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 và chuyn vào cây thuc lá, kt qu biu hin protein  cây chuyn gen chng minh ct k hot ng tt  thuc lá. iii) Thông qua h thng, ging lc LVT c th nghim chuyn gen GUS và chuyn cu trúc mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2. Biu hin GUS  c trên phôi soma và cây lc hoàn chc 4 dòng lc  th h T0 mang gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 qua kiu vi phn ng PCR. iv) Lun án tc quy trình chuyn gen hoàn chnh thông qua mô so và phôi soma  cây lc nhm phc v to cây lc chuyn gen theo mi thin kh ng chu vi tình trng thic t ng. c và thc tin 5.1. Ý nghĩa khoa học 4 i) Kt qu nghiên cu ca lun án cung cp dn liu khoa hc v ng dng k thut chuyn gen nhm phc v vic ci thin tính chu hn ca cây lc. ii) Cung cp thông tin v nhân t phiên mã NAC và gen NAC2  cây lc. Kh u hn  các ging lc nghiên cu và vai trò ca gen NAC2 ng vi s thic t ng. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kt qu  u hn ca cây lc  m mô sc s d  ng dng bin pháp ci thin kh u hn ca cây lc. Kt qu c ban u v cây lc chuyn gen s    các m tip theo nhm phc v các nghiên cu v ci thin tính chu hn ca cây lc. 6. Cu trúc ca lun án Lun án gm 103 trang (k c tài liu tham khc chia thành các phn: M u gm 2 ng quan tài liu, 40 t li5  Kt qu và tho lun, 47 trang; Kt lu   ngh: 1 trang; Các  n lun án: 1 trang; Tài liu tham kho: 14 trang vi 134 tài liu tham kho bng ting Vit và ting Anh. Lun án có 25 bng s liu, 36 hình.  TNG QUAN TÀI LIU Lu kho và tng kt 17 tài lic, 117 tài lic ngoài vi các ni dung liên quan, bao gm: (1) Hn và ng ca hn thc vt; (2) Các nhân t phiên mã liên quan n tính chu hn  thc vt; (3) Nâng cao kh  chu hn ca cây 5 trng bng k thut chuyn gen. Vi các dn liu thu thc, kt qu ng nh, lc là cây nông nghip ngc trng ph bin trên th gii. Xu th bi  i chung ca khí hu làm cho hn hán bt ng xy ra  nhi sut cây trc. Nhng hiu bit v  chu hn giúp hiu rõ v c tính chng chu ca thc vt và cây l    trong nhng nghiên cu v kh   ng vi tình trng thic t ng.  chu hn ca thc vt rt phc tp, không ch m hình thái gii phu mà n nhi thành phn hoá sinh trong t bào, s u chnh hong cn tính chu hn ca thc vt. Thành công ca k thut chuyc công b trên nhiu loài cây trng và nhin kh u hn ca thc vc ci thin. Hing tìm kin tính chng chu ca cây trni vu kin sinh thái phi sinh hc bt l ng th nht là tìm nhng gen liên quan trc ti n kh u hn, chu lnh, ngp úng hay phèn mng th hai nghiên cu v gen chng chng các yu t u khin ví d iption factor (TF) nhm tip cu hòa tng th  a thc vt khi gu kin bt li.  NAC   TF   .  mã NAC có liên quan v chvi nhiu quá trình khác nhau trong  thc vt, phát trin, quá trình lão hóa,  ng các stress sinh hc và phi sinh hc. Nhiu nghiên cu ch yu tp trung vào to dòng và phân ln hn hán 6 trong h    ANAC019, ANAC055, và ANAC072  Arabidopsis, BnNAC   , AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3, AhWSI 153, AhWSI 308  cây  GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4 tr  , ONAC045, SNAC1  lúa, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8  lúa mì Sau khi phân lp, nh   c thit k vi các promoter mc hi và chuyn thành công vào mt s loài thc vt nh k thut chuyn gen. Mt s nghiên cu công b c cây trng chuyn gen thành công có kh ng chng chu kin thiu c cA.thaliana, thuCác kt qu thu u chng minh vi ng chu ti các u kin bt li t  mui cao, nhi thp, nhi cao, khô hn, t i thic s ng và phát trin.  NAC2   VT LI 2.1. Vc vt Lun án s dng ht ca 10 ging lc có kh u hn khác nhau do Trung tâm Nghiên cu và Phát tri - Vin Cây c và Cây thc phm cung cp. 2.2. Hóa cht và thit b Các loi hoá cht tinh khit và thông dng có ngun gc t các hãng     Taq-  c hiu c gel và tách plasmid,   enzyme . Các 7 chng c pháp nghiên cu 2.3  giá nhanh tính chu hn bi khô mô so theo Lê Tr.  u hn  n cây non theo Lê Tr. ng proline ba  2.3 dng trong nuôi cy in vitro To các dòng thuc lá và lc bng k thut nuôi cy in vitro. Ging thuc cung cp t phòng Công ngh t bào thc vt vic 3-4 lá thc s d tin hành các thí nghim phc v cho chuyi và chuyn gen, to cây hoàn chnh.  lc qua mô so hóa và phôi soma c tin hành da mt s tác gi . To mô so trong ti 10 ngày, to phôi soma trong 7 tun, tái sinh cây và to cây hoàn chnh. n gen thông qua mô sc tin hành da trên nghiên cu ca mt s tác gi. 2.3c phân t Nghiên cu thông tin v gen và thit k cp mi nhân gen: Các c thao tác: i) thu thp trình t nucleotit t ngân hàng gen NCBI; ii) thit k cp mi; iii) Kim tra chng cp mi bng PCR. Tách chit DNA tng s . Tách chit RNA tng s bng Trizon. c tng hp theo quy trình RevertAid TM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit. 8 Phân lp gen bng k thut PCR, RT-PCR. Tách dòng gen pháp c nh trình t gen trên máy phân tích trình t t ng theo a Sanger. Thit k cu trúc chuyn gen: các phn ng ct, ghép ni to vector, to vector tái t hp và bin np vào t bào A.tumefacien bn. Phân tích biu hin gen GUS bng nhum hóa mô t bào theo  (1987).  có mt ca protein do gen chuyn to ra bng k thua (2001).  lý s liu Các s lic x ng kê sinh hc trên máy vi tính bng phn mm Excel. Phân tích gen bng phn mm BioEdit và DNAstar. 2.4m nghiên cu Phòng Công ngh T bào thc vt, Phòng thí nghim trng m Công ngh gen  Vin Công ngh Sinh hc.  KT QU VÀ THO LUN 3.1. ánh giá kh u hn ca các ging nghiên cu  u thi khô  n mô so Thi khô mô sc s dt bi ng ca s mn kh u khô hn, chu nóng ca t bào thc vt. Bi khô mô so ca các ging lúa, ging lc, nhiu công trình nghiên cu ca các tác gi  chn lc nhng dòng mô có kh c nhi cao, 9 chc hing khô khi mc sau khi b x u kin nuôi cy. 3.1.1.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống nghiên cứu Kh o mô so là thông s u tiên phn ánh kh  thích ng ca mô vi môi trng nghiên cu nhm s dng cho các thí nghim sau này trong vi u hn ca các ging lc. Chúng tôi s dng ngun mu t phôi trc ht lc ng có b sung chng 2,4D. Kt qu nghiên cu cho thy, tt c các ging lc nghiên cu u có kh o mô so. Kh o mô so cao nht quan sát thy  ging L12 và L16 (100%), thp nht là ging LVT (69,56 %). Ngun mô so thu nhn s c s dng trong các thí nghim  u hn ca các ging lc  n này. 3.1.1.2. Khả năng giữ nước của mô sẹo các giống nghiên cứu   mc ca mô so chúng tôi tin hành x lí thi khô c khi mô so và chia tách mô so vi các t l khác nhau (1/2, 1/4, 1/8) bng lung khí vô trùng ca box cy. Tin hành thi khô 3h, 6h, 9 h liên t mc ca mô so. Kt qu thí nghim cho th  m c ca mô so các ging lc sau x lý bi th   i khác nhau tùy vào mi ging. T mc nhanh nht quan sát thy sau 3h thi khô c ca mô so gi tt c các ging. T mc sau 3h th nguyên c khi mô so là ít i mô so thng  mc cao nht và gi mc thp nht là L12 sau 3h thc tip tc gim sau 6h thi khô tip theo so vi trng mô su. 10 3.1.1.3. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo các giống nghiên cứu Kh  c ca mô so các ging nghiên cu sau x lý bi thi khô n t l sng sót ca mô so. T kt qu x lý mc mô so cho thy, t l sng sót ca mô so t l nghch vi thi gian x lý th  ging có t l sng sót ca mô so là ln nht  hu ht các ng x ng vi thi gian thi khô là 3, 6, 9h). TB25 là ging có t l sng sót thp nht,  ng 9h ch còn 40,63%. T l sng sót cao quan sát thy  khi mô so chia tách 1/2. Kh c hi thp quan sát thy  khi mô so chia tách 1/4 và 1/8. T l sng sót thp nht 12,50%  ging TB25 sau 9h thi khô (chia tách 1/4) và 12,00%  ging LVT sau 9h thi khô (chia tách 1/8).  u hn  n cây non Tỷ lệ cây héo, tỷ lệ cây phục hồi sau hạn nhân tạo Kt qu c sau khi x lý hn nhân to  n cây non bng cách ngc  các thm khác nhau trong quá trình thí nghim cho thy, t l cây không héo gim dn theo các thi m gây hn. T l cây phc hi gim dn theo các thm gây hn.  thm h các ging phc hi toàn b, ch có 4 ging L08, L15, LVT, TB25 t l  c hi thp nht quan sát thy  ging TB25 (55,24%). Sau 7 ngày gây hn ging có kh c hi cao nht là L12 (73,34%) và thp nht là LVT (18,18%). T l phc hi rt thp sau 9 ngày gây hn, phn héo ca cây phc hi chi, lá xanh tr li rt ít. T l phc hi thp nht quan sát thy  ging TB25 (2,94%) . Ging L12 có kh c h (30,38%). [...]... truyền học Mã số: 62 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 26 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Lê Trần Bình Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Vào hồi giờ ngày tháng năm 20 : 27 CÁC CÔNG... thủ này với các trình tự amino acid trong họ trên ngân hàng gen quốc tế (Hình 3.9) Khi nghiên cứu về trình tự amino acid của gen NAC2 thu được, chúng tôi nhận thấy v ng bảo thủ NAC, có khoảng 160 amino acid từ đầu N tương tự như các gen trong họ So sánh vùng bảo thủ NAC giữa gen NAC2 và một vài gen trong họ NAC thu được các phân vùng bảo thủ từ A đến E được chỉ ra trong các khung đen của vùng NAC (hình... các gen trong họ NAC bằng phần mềm Clustal W (A – E: các phân vùng bảo thủ thuộc vùng NAC) 15 3.2.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào v ng ảo hủ Dựa vào sự phân nhóm các protein thuộc họ NAC được đề cập trong các nghiên cứu đã công bố Chúng tôi tiến hành phân tích và so sánh v ng NAC của gen NAC2 thu được với các v ng NAC của các gen thuộc họ NAC Kết quả phân tích trình tự tương đồng trong v... nước Hàm lượng amino acid 19 proline là một chỉ tiêu được phân tích trong đánh giá cây thuốc lá chuyển gen Khi gặp điều kiện khô hạn, proline sẽ được tổng hợp tăng trong tế bào Quan sát về mặt hình thái trong quá trình xử lý hạn cho thấy, sau 9 ngày ở điều kiện thiếu nước, các dòng cây thuốc lá chuyển gen vẫn sinh trưởng bình thường trong khi cây thuốc lá không chuyển gen bắt đầu có hiện tượng h o lá... cho vi c tạo rễ cây lạc Giá thể (1 đất:1 trấu hun:1 cát vàng) làm nguyên liệu đưa cây lạc in vitro ra tự nhiên Sau hai tuần chúng tôi chuyển cây ra đất 3.4.2 Chuyển gen chỉ thị GUS thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Hiệu suất của quá trình chuyển gen không chỉ phụ thuộc vào hệ thống tái sinh mà còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có đặc điểm di truyền của giống Một số nghiên cứu chuyển gen thành... cấu trúc gen chịu hạn mang nhân tố phiên mã NAC2 vào mô sẹo giống lạc LVT thông qua vi khuẩn A tumefaciens theo quy trình đã được tối ưu Quá trình chuyển gen được tiến hành trên 4 lô thí nghiệm với tổng số 935 mẫu được sử dụng cho chuyển gen, có 595 mẫu tạo phôi 23 soma, 1416 chồi hình thành, trong quá trình chọn lọc kháng sinh có 189 cây sống sót trên giá thể và trồng ở nhà lưới Hình 3.26 Hình ảnh chuyển... tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid của gen NAC2 với các nhân tố phiên mã NAC khác, nhận thấy vị trí amino acid thay đổi 115 của gen NAC2 so với gen AhNAC2 lại tương đồng hoàn toàn với các trình tự amino acid còn lại trong họ gen NAC ở các đối tượng thực vật này Do đó chúng tôi kết luận trình tự gen NAC2 thu được từ giống lạc L12 chỉ có một vị trí amino acid thứ 78 thay đổi sau khi so sánh vùng... và tăng so với đối chứng Đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra Nhằm đánh giá cây trồng sau chuyển gen, chúng tôi tiến hành kỹ thuật lai Western với mong muốn kiểm tra sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra Trước hết protein toàn phần được tách chiết từ mẫu thuốc lá chuyển gen, điện di trên gel polyacrylamid, thấm truyền lên màng nitrocellulose rồi lai với kháng thể Quá trình hiển thị... chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đã thu được 4 cây dương tính với phản ứng PCR chiếm tỷ lệ 0,43 % số mẫu biến nạp (dòng 24, 49, 52, 89 – hình 3.25) Các dòng cây được tiếp tục trồng để thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các thế hệ sau 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kế ận 1 Các giống lạc nghiên cứu được xếp thành 3 nhóm... lượng proline được xem như chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá khả năng chịu hạn Chúng tôi đã tiến hành phân tích hàm lượng proline ở giai đoạn cây non ở thời điểm: trước hạn và sau hạn Proline như tín hiệu phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan của môi trường Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng proline sau hạn tăng nhiều so với trước khi gây hạn Trong đó, giống L12 có tỷ lệ tăng cao nhất . cứu Kh o mô so là thông s u tiên phn ánh kh  thích ng ca mô vi môi trng nghiên cu nhm s dng cho các thí nghim sau này trong vi  u hn ca các. v ci thin tính chu hn ca cây lc. 6. Cu trúc ca lun án Lun án gm 103 trang (k c tài liu tham khc chia thành các phn: M u gm 2 ng quan tài liu,.  n lun án: 1 trang; Tài liu tham kho: 14 trang vi 134 tài liu tham kho bng ting Vi t và ting Anh. Lun án có 25 bng s liu, 36 hình.  TNG