Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ KIM DUNG XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thái Nguyên, năm 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ KIM DUNG XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đặng Xuân Bình Thái Nguyên, năm 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự giúp đỡ của TS. Đặng Xuân Bình. Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã luôn nhận được sự giúp đỡ quý báu, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy: T.S Đặng Xuân Bình người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống, tập thể lãnh đạo và cán bộ Chi cục Thú y tỉnh Cao Bằng cùng gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2010 Nguyễn Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Ở Việt Nam 4 1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng 5 1.3. Mầm bệnh 10 1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu 11 1.3.2. Đặc tính nuôi cấy 12 1.3.3. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida 15 1.3.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 16 1.3.5. Serotype của vi khuẩn P. multocida 18 1.3.6. Độc lực của vi khuẩn P. multocida 21 1.3.7. Sức đề kháng 22 1.4. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây nên 23 1.4.1. Cơ chế sinh bệnh 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.4.2. Biể u hiệ n đặ c trưng của trâu bò mắc bệnh tụ huyết trùng 23 1.5. Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh 25 1.5.1. Một vài nét về lịch sử phát triển của vắc xin 25 1.5.2. Thành phần của vắc xin 26 1.5.3. Công nghệ lên men vi khuẩn trong chế tạo vắc xin 30 1.5.4. Phân loại vắc xin 30 1.5.5. Vắc xin tại chỗ (autovaccine) 33 Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 34 2.1.1. Đối tượng 34 2.1.2. Thời gian và địa điểm 34 2.2. Nội dung nghiên cứu 34 2.2.1. Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng 34 2.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ 34 2.2.3. Chế tạo vắc xin tại chỗ phòng bệnh tụ huyết trùng 35 2.3. Vật liệu dùng cho nghiên cứu 35 2.3.1. Mẫu dùng phân lập vi khuẩn 35 2.3.2. Động vật thí nghiệm 35 2.3.3. Hóa chất và dụ ng cụ nghiên cứ u 35 2.3.3.1. Hoá chất dùng để nhuộm Gram 35 2.3.3.2. Hoá chất dùng để thử phản ứng sinh hoá 35 2.3.4. Môi trườ ng nuôi cấ y, phân lập vi khuẩ n 36 2.3.5. Dụng cụ thí nghiệ m 36 2.4. Phương pháp nghiên cứu 36 2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ 36 2.4.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P. multocida 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập 37 2.4.2.2. Phương pháp xác định các đặc tính sinh vật, hóa học 38 2.4.3. Phương phá p thử độ c lự c trên chuộ t nhắt trắng 41 2.4.4. Phương phá p thử khá ng sinh đồ 42 2.4.5. Chế tạo vắc xin tại chỗ theo tiêu chuẩn ngành 42 2.4.5.1. Phương pháp tính LD 50 của P. multocida trên chuột 42 2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 43 2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin 43 2.4.6. Phương phá p xử lý số liệ u 45 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 46 3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 47 3.1.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 48 3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ 50 3.1.4. Triệu chứng đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 53 3.1.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ tại tỉnh Cao Bằng 54 3.1.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ dịch theo lứa tuổi 56 3.1.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại một số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng 58 3.1.8. Xác định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida bằng phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 59 3.1.9. Kết quả xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.10. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được với một số loại kháng sinh 61 3.2. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò 62 3.2.1. Chọn chủng vi khuẩn P. multocida sản xuất vắc xin 62 3.2.2. Xác định liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) 64 3.2.3. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine 65 3.2.4. Kiểm tra an toàn và hiệu lực của autovaccine trên động vật thí nghiệm 66 3.2.5. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine 68 3.2.5.1. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 1 và 2 năm tuổi 68 3.2.5.2. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 3 năm tuổi 68 3.2.6. Theo dõi sự biến động về chỉ tiêu thân nhiệt và tần số hô hấp ở trâu, bò sau khi tiêm autovaccine 71 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74 1. Kết luận 74 2. Đề nghị 75 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI: Brain Heart Infusion Cs: Cộng sự DNA: Deoxyribonucleic Acid ĐC: Đối chứng FAO: Food and Agriculture Oganization LD 50 : Lethal Dose 50 - Liều gây chết 50% MR: Methyl Red PCR: Polymerase Chain Reaction P. multocida: Pasteurella multocida TN: Thí nghiệm VP: Voges Proskauer YPC: Yeast extract Pepton - L - Cystin 37 0 C/24h : Bồi dưỡng trong tủ ấm 37 0 C trong 24 giờ + Chú thích CB6: Mẫu nghiên cứu số 6 tại Cao Bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tóm tắt danh pháp của P. multocida 11 Bảng 1.2. Hệ thống phân loại P. multocida 20 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 47 Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 - 2009 49 Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ 51 Bảng 3.4. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 53 Bảng 3.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ 55 Bảng 3.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ dịch theo lứa tuổi 57 Bảng 3.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của vi khuẩn P. multocida phân lập 58 Bảng 3.8. Kết quả thử độc lực của các chủng P. multocida phân lập 60 Bảng 3.9. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P. multocida phân lập 62 Bảng 3.10. Kế t quả chọn chủng vi khuẩn P. multocida để chế tạo autovaccine 63 Bảng 3.11. Kết quả xác định LD50 64 Bảng 3.12. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine trong phòng thí nghiệm 65 Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của các lô autovaccine 67 Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 1 và 2 năm tuổi 69 Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 3 năm tuổi 70 Bảng 3.16. Kết quả theo dõi biến động về chỉ tiêu thân nhiệt và tần số hô hấp 72 [...]... thí nghiệm của Vi t Nam, chúng tôi đề xuất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 được thực hiện đề tài: Xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại một số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng và bước đầu thử nghiệm auto-vaccine 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn tỉnh. .. bệnh tụ huyết trùng xảy ra mạnh ở các tỉnh phía Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc Trong những năm 70 có 80% số ổ dịch tụ huyết trùng và 84% số thiệt hại gia súc do bệnh tụ huyết trùng thuộc về các tỉnh ở phía Nam Đến những năm 90 phân bố địa lý của bệnh nghiêng về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên nhiều, hàng năm có 20 – 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành Ở. .. không có dịch tụ huyết trùng trâu, bò thì tỷ lệ trâu, bò khoẻ mang trùng là 3%, còn ở nơi có dịch tụ huyết trùng thì tỷ lệ mang trùng là 44,4% Gupta (1980) [51] nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng tại Ấn Độ thấy tỷ lệ mang trùng ở trâu, bò khoẻ ở vùng không có dịch là 0%, ở vùng ít xảy ra dịch là 1,9% còn ở vùng dịch hay xảy ra là 5 – 6% Ngay ở các vùng có dịch thì tỷ lệ mang trùng ở đàn trâu, bò khoẻ mạnh... trùng ở trâu, bò phát triển như sau: Bệnh tụ huyết trùng phát sinh ở các vùng nóng ẩm Vào mùa mưa, vi khuẩn có sẵn trong đất, được nước mưa đưa lên mặt đất, dính vào rơm, cỏ và trôi vào các hồ, ao, mương, máng Trâu, bò ăn phải rơm cỏ và uống nước có nhiễm khuẩn sẽ mắc bệnh Bình thường một số trâu, bò khỏe cũng mang vi khuẩn tụ huyết trùng trong hệ thống hô hấp và tiêu hóa Nhưng vi khuẩn không gây bệnh và. .. bàn tỉnh Cao Bằng; - Khảo sát sự lưu hành vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò; - Xác định type giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được; - Thử nghiệm hiệu quả bảo hộ và tính an toàn trên động vật thí nghiệm của autovaccine phòng bệnh tụ huyết trùng 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học: - Bổ sung tư liệu về đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò, sự... người có nhiều đóng góp nghiên cứu phát hiện ra loại vi khuẩn này, năm 1887 Trevisan đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn là Pasteurella (De Alwis, 1992) [47] Do Pasteurella gây bệnh cho nhiều loài gia súc nên tên của vi khuẩn, theo những năm trước đây được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh: Pasteurella suiseptica gây bệnh ở lợn Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò Pasteurella oviseptica gây bệnh ở. .. chỉ bệnh do vi khuẩn Pasteurella gây ra Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu, P multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài gia súc gia cầm Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau, nhưng P multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau 1.1.2 Ở Vi t Nam Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958) [3], bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được... Cholera), bệnh ở lợn do Loeffer phát hiện năm 1886 Cùng năm 1886 nhận thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh và có sự tương đồng về vi khuẩn gây bệnh phân lập từ các loài động vật nói trên, Hueppe gọi chung là vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết, xuất huyết và đặt tên là Bacillus septicaemia Năm 1887, Oreste và Annani đã mô tả một bệnh ở trâu do một loại vi khuẩn tương tự gây ra và gọi đó là bệnh ―Barbone‖... nitrat và thiếu ánh sáng Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm Vi khuẩn trong da đun sấy khô từ từ có thể giữ độc lực 15 – 25 ngày, trong tổ chức thối nát vi khuẩn sống tương đối lâu hơn, từ 1 – 3 tháng nếu nhiệt độ dưới 20oC 1.4 Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P multocida gây nên 1.4.1 Cơ chế sinh bệnh Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [15] bệnh tụ huyết trùng. .. của vi khuẩn Pasteurella multocida; - Bổ sung tư liệu về kết quả phân lập và giám định đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida, kết quả xác định type vi khuẩn Pasteurella multocida bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) * Ý nghĩa thực tiễn - Là cơ sở để xác định biện pháp phòng bệnh có hiệu quả; - Là cơ sở để nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh đạt hiệu quả phòng hộ cao Số . gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại một số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng và bước đầu thử nghiệm auto-vaccine . 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết. KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE LUẬN VĂN THẠC