Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _____________  ______________ TRỊNH QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM LUẬ N VĂN THẠ C SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C Thái Nguyên – 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _____________  ______________ TRỊNH QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬ N VĂN THẠ C SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên – 2011 Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm do vi trùng lao (còn gọi là vi trùng Koch hay BK) gây ra, có thể lây nhiễm từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành. Bệnh có thể gặp ở tất cả các bộ phận của cơ thể, trong đó lao phổi là thể lao phổ biến nhất (chiếm 80 - 85%) và là nguồn lây chính cho ngƣời xung quanh, nhƣng nó cũng dễ ảnh hƣởng đến hệ thần kinh trung ƣơng dẫn đến bệnh lao màng não, ảnh hƣởng hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn dẫn đến bệnh lao kê. Bệnh có thể chữa khỏi mà không để lại di chứng nếu nhƣ đƣợc phát hiện sớm, điều trị kịp thời. Tuy nhiên, nếu ngƣời bệnh điều trị không đúng cách (bỏ dở điều trị hoặc dùng thuốc không đúng theo chỉ dẫn của thầy thuốc) sẽ gây hậu quả nghiêm trọng nhƣ: Bệnh không khỏi, dễ để lại di chứng hoặc gây tử vong; gây ra hiện tƣợng kháng thuốc, nguy hiểm nhất là kháng đa thuốc làm cho việc điều trị càng khó khăn và tốn kém hơn; tiếp tục là nguồn lây nhiễm trong cộng đồng. Việc điều trị lao đa kháng thuốc rất phức tạp và khó khăn. Chi phí điều trị cao, thời gian điều trị kéo dài. Tỷ lệ khỏi bệnh thấp, tỷ lệ bỏ trị và tử vong của bệnh nhân cao. Hiện nay, để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc các cơ sở y tế trong nƣớc vẫn phải dựa vào phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn lao và làm kháng sinh đồ kéo dài ít nhất 4 - 6 tuần nhƣ vậy sẽ gặp khó khăn trong việc điều trị. Sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc và khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên. Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kháng thuốc là do xảy ra đột biến trong các khu vực của hệ gen MTB, nhƣ: katG, inhA, ahpC, kasA và ndh liên quan đến tính kháng isoniazid (INH), ropB kháng rifampicin (RIF), embB kháng ethambutol (EMB), pncA kháng pyzamid (PZA) và rpsL, rrs liên quan đến tính kháng streptomycin (STR). Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: "Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Miền Trung - Việt Nam ". 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát hiện đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính kháng isoniazid ở các chủng lao nghiên cứu. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đờm của các bệnh nhân - Kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số bằng đo OD260nm / 280nm = 1,8 - 2,2 - Nhân bản đoạn gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli - Tách dòng gen katG và gen inhA - Giải trình tự gen katG và gen inhA - Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu. Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U 1.1 Tnh hnh bnh lao 1.1.1. Tnh hnh bệnh lao trên thế gii Nhƣ chú ng ta đã biế t, lao là mộ t trong nhƣ̃ ng bệ nh nhiễ m trù ng mã n tí nh xuấ t hiệ n sớ m nhấ t ở loà i ngƣờ i và có khả năng lây truyề n trong cộ ng đồ ng , là mối đe dọa lớn với tất cả mọi ngƣời trên hành tinh này . Nế u không có sƣ̣ kiể m soá t củ a con ngƣờ i bằ ng nhƣ̃ ng phƣơng phá p và công cụ hƣ̃ u hiệ u, bệ nh lao có thể bù ng phá t nhƣ mộ t bệ nh dị ch nguy hiể m , làm chết nhiều ngƣời và tác động xấu đến sự phát triể n kinh tế xã hộ i. Hiệ n nay, trên thế giớ i có khoả ng 2,2 tỷ ngƣời đã nhiễm lao (chiế m 1/3 dân số thế giớ i ), tỷ lệ điều trị thành công trên 85% bằ ng hoá trị liệ u , nhƣng tỷ lệ phá t hiệ n chỉ đạ t 37% số bệ nh nhân ƣớ c tính . Nhƣ vậ y , còn rất nhiều bệnh nhân lao không đƣợ c chƣ̃ a trị đa ng tiế p tụ c lây lan cho cộ ng đồ ng và theo ƣớ c tính củ a Tổ chƣ́ c Y tế Thế giớ i (TCYTTG), mỗ i năm có thêm 1% dân số thế giớ i bị nhiễ m lao (65 triệ u ngƣờ i) [3], [11]. Năm 1993, Tổ chƣ́ c Y tế Thế giớ i (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạ n g khẩ n cấ p toà n cầ u củ a bệ nh lao và mố i hiể m họa của nó trong tƣơng lai là bệnh lao kháng thuố c [3], [11]. Năm 2005, TCYTTG ƣớ c tí nh khu vƣ̣ c Đông Nam Á có 4,8 triệ u bệ nh nhân lao. Trong đó số ca bệ nh nhân lao mắ c mớ i là gầ n 3 triệ u, chiế m 34% toàn cầu. Số ngƣờ i chế t ở Đông Nam Á lá 512000 ngƣờ i, chiế m 1/3 toàn thế giới . Châu Phi có số bệ nh nhân lao là 3,8 triệ u ngƣờ i ; số ca mớ i mắ c là 2,5 triệ u; số chế t do bệ nh lao là 544000. Hai khu vƣ̣ c nà y có tình hình mắc lao nặng nề nhất thế giới [15]. WHO dƣ̣ bá o chi phí điề u trị cho bệ nh nhân lao ở 27 nƣớ c có số bệ nh nhân đông nhấ t sẽ lên đế n 16 tỷ USD trong vòng 6 năm tớ i và coi bệ nh lao là vấ n đề y tế cộ ng đồ ng, là một trong nhƣ̃ ng nguyên nhân chính gây tƣ̉ vong trên thế giớ i . Không nhƣ̃ ng thế , nhiề u vấ n đề mớ i nả y sinh, thậ m chí đƣợ c đá nh giá là nghiêm trọ ng trên Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 toàn cầu làm cho công tác phòng , chố ng lao gặ p khó khăn , đe dọa phá vỡ nhƣ̃ ng thành quả đạ t đƣợ c . Báo cáo của WHO đƣợc đƣa ra dựa trên thông tin thu thập trong thời gian từ 2002-2006 ở 1/2 các nƣớc trên thế giới do các nƣớc còn lại không hợp tác. Chẳng hạn tại Châu Phi chỉ có 6 nƣớc cung cấp thông tin về lao kháng thuốc cho WHO. Trƣớc tình hình trên, WHO thúc giục các quốc gia và tổ chức từ thiện trên thế giới tập trung đầu tƣ vào DOTS- một chiến dịch chuẩn hóa cách phát hiện, điều trị đƣợc mở rộng. Đồng thời tổ chức y tế này cũng vừa đƣa ra chƣơng trình DOTS- Plus (chƣơng trình DOTS mở rộng) liên quan đến việc sử dụng thuốc đa dạng nhằm chống lại các dòng MDR. Việc kiểm soát dịch bệnh ở từng nƣớc sẽ không thể ngăn chặn sức kháng thuốc của khuẩn lao, chỉ có sự đầu tƣ đồng bộ vào các chiến dịch phòng chống bệnh trên toàn thế giới mới phát huy tác dụng [3], [13]. Tƣ̀ năm 2000 đến năm 2008, cơ quan phá t triể n quố c tế hoa kỳ (USAID) đã cung cấ p gầ n 900 triệ u đô la cho chƣơng trình phò ng , chố ng lao toà n thế giớ i . Trong năm tà i khoá 2009, USAID đã cung cấ p 15 triệ u đô l a cho cơ sở sả n xuấ t thuố c chố ng lao toà n cầ u (DF). Bệ nh lao là bệ nh củ a ngƣờ i nghè o , lây lan nhanh trong cộ ng đồ ng có điề u kiệ n số ng chậ t chộ i, thiế u vệ sinh, thông khí và dinh dƣỡ ng kém. Mƣ́ c độ nặ ng nề củ a bệ nh lao đã ả n h hƣở ng tớ i thu nhậ p quố c dân và chỉ số phát triển con ngƣời của các quốc gia . Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy , mỗ i bệ nh nhân lao sẽ mấ t trung bình 3-4 tháng lao động , làm giảm 20-30% thu nhậ p bình quân của gia đình và nó đã tác động tới 70% đố i tƣợ ng lao độ ng chính củ a xã hộ i [3], [6]. Đáng buồn là vào thời điểm hiện tại, đã 129 năm kể từ ngày nhà bác học ngƣời Đức Robert Koch công bố tìm ra nguyên nhân gây ra bệnh lao thì căn bệnh này vẫn chƣa đƣợc khống chế. Có nhiều cách lý giải thực trạng này song chúng ta thấy đƣợc một số lý do chủ yếu nhƣ sau: Sự xuất hiện và mức độ hoành hành ngày càng tràn lan của đại dịch HIV/AIDS; tình hình bệnh lao kháng thuốc; sự xuống cấp của cơ sở y tế điều trị và chăm sóc bệnh nhân lao cũng nhƣ sự thiếu quan tâm đến công tác phòng , chống lao tồn tại ở một số quốc gia, đặc biệt là những nƣớc kém hoặc đang phát triển. Thêm vào đó là tình trạng di dân giữa các quốc gia, từ những Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 nƣớc có số ngƣời mắc lao cao sang những nƣớc có số ngƣời mắc lao thấp; tình trạng di dân, đô thị hóa trong mỗi quốc gia; tình trạng nghèo đói và đặc biệt là các phƣơng tiện để chẩn đoán và điều trị lao trong nhiều năm qua vẫn chƣa có đổi mới đáng kể [38]. 1.1.2. Tnh hnh bệnh lao  Việt Nam Theo Ủy ban điề u phố i liên minh phò ng , chố ng lao toà n cầ u , Việ t Nam xế p thƣ́ 12 trong 22 nƣớ c có gá nh nặ ng bệ nh lao trên toà n cầ u, cao hơn nhiề u bậ c so vớ i nhiề u năm trƣớ c đó . Hàng năm, Việ t Nam có khoả ng 150.000 bệ nh nhân lao cá c thế hệ xuấ t hiệ n và khoả ng 12.000 ca đồ ng nhiễ m lao/HIV. Việ t Nam là nƣớ c có nhiề u bệ nh nhân lao đƣ́ ng hà ng thƣ́ ba ở khu vƣ̣ c Tây Thá i Bì nh Dƣơng , sau Trung Quố c và Philippin. Tỷ lệ dân số Việ t Nam mắ c lao là 44%. Tỷ lệ kháng th uố c là 32,5% khá cao so với trong khu vực . Vớ i nguy cơ mắ c lao ƣớ c tính hà ng năm là 1,7%. Tỷ lệ chế t do lao khá cao : 26/100.000 dân tƣơng đƣơng vớ i 20.000 ngƣờ i chế t do lao mỗ i năm. Nhƣ vậ y, ở Việt Nam cứ mỗi ngày có gần 400 ngƣờ i mắ c bệ nh lao và 55 ngƣờ i chế t vì bệ nh lao. Kế t quả điề u tra dịch tễ cho thấ y nguyên nhân bệ nh lao vẫ n tiế p tụ c tăng ở Việ t Nam do tỷ lệ lao tăng ở nhó m tuổ i trẻ và công tá c giá m sá t lao chƣa đƣợ c quan tâm đú ng mƣ́ c, nguồ n nhân lƣ̣ c cho công tá c phò ng, chố ng lao ngà y càng mai một ; 50% số cá n bộ y tế phò ng, chố ng lao cấ p huyệ n chƣa đƣợ c đà o tạ o đang là thƣ̉ thá ch lớ n vớ i công tá c phò ng, chố ng lao tạ i Việ t Nam [11]. Một khảo sát vào năm 2004 của chƣơng trình chống lao quốc gia cho thấy địa phƣơng nào có mật độ và lƣu chuyển dân số đông, y tế tƣ và hiệu thuốc phát triển thì nơi đó có tỷ lệ điều trị thất bại, tái phát, mãn tính của bệnh lao cũng cao nhất. Cụ thể số bệnh nhân tái phát và thất bại ở Đà Nẵng là 48, Cần Thơ 195 An Giang 570 và TP.HCM là 1.664 [2]. Nƣớ c ta thuộ c loạ i trung bình về dịch tễ trên thế giớ i. Đội ngũ cán bộ chống lao cá c cấ p hiệ n nay là 15772 (20/100.000 dân). Số cá n bộ nà y tậ p trung chủ yế u ở các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung bộ . Trong khi đó , các tỉnh phía Nam , bao gồ m Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 TP.HCM nơi có số bệ nh nhân hà ng năm cao nhấ t cả nƣớ c , chỉ đạt 10 cán bộ cho 100.000 dân [3]. Tình hình đồng nhiễm lao/HIV đang là một thách thức lớn và đƣợc đánh giá là rất nghiêm trọng. Lao là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở ngƣời nhiễm HIV. Theo thống kê của chƣơng trình chống lao quốc gia, hiện nay tại tất cả các tỉnh, thành phố trong cả nƣớc đều có ngƣời đồng nhiễm lao và HIV. Ngƣời đồng nhiễm lao/HIV tập trung ở những tỉnh, thành phố có nhiều ngƣời nhiễm HIV và mắc lao: TP. Hồ Chí Minh, An Giang, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Lạng Sơn Qua khám sàng lọc lao cho 5.114 ngƣời nhiễm HIV cho thấy, có 18,6% số nhiễm HIV có mắc lao; khoảng 90% số ngƣời nhiễm lao/HIV ở lứa tuổi 18-40. Đáng chú ý, qua giám sát trọng điểm có 5% số ngƣời bệnh lao có HIV, tỷ lệ này tăng gấp 10 lần so với năm 1990. Sự gia tăng của đại dịch HIV/AIDS làm cho bệnh nhân lao lại càng thêm trầm trọng vì 50% số ngƣời nhiễm HIV sẽ trở thành bệnh lao nếu nhiễm vi khuẩn lao [3]. Theo kết quả điều tra dịch tễ lao toàn quốc 2006-2007, tình hình bệnh lao ở nƣớc ta cao hơn ƣớc tính của Tổ chức Y tế Thế Giới 1,6 lần. Đặc biệt, bệnh lao đang có xu hƣớng giảm ở lứa tuổi già và có xu hƣớng tăng ở lứa tuổi trẻ. Ở lứa tuổi 15-24, tỷ lệ phát hiện lao phổi AFB dƣơng tính mới trên 100.000 dân tăng từ 29,5 (năm 2000) lên 37,5 (năm 2008) đối với nam giới còn ở nữ giới là từ 16,9 lên 22,8 [10]. Năm 2006, Chƣơng trình chống lao quốc gia đã xây dựng kế hoạch phòng , chố ng lao giai đoạ n 2006-2010. Vớ i mụ c tiêu phá t hiệ n đƣợ c trên 70% số bệ nh nhân lao và điề u trị khỏ i cho 90% số bệ nh nhân lao đã đƣợ c phá t hiệ n , đến nay, chiế n lƣợ c DOTS (điề u trị lao bằ ng hoá trị liệ u ngắ n ngà y có kiể m soá t trƣ̣ c tiế p ) đã đƣợ c triể n khai tạ i 100% số huyệ n trong cả nƣớ c và tiế p tụ c xây dƣ̣ ng kế hoạ ch phòng, chố ng lao giai đoạ n 2010-2015 [10], [14]. Việt Nam là một trong 7 quốc gia có tình hình lao nghiêm trọng nhất thế giới (Cambodia, China, Mongolia, Papa New Guinea, Philippines, Vietnam). Đến cuối Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 2003, Việt Nam là nƣớc duy nhất trên thế giới đã đạt đƣợc mục tiêu phát hiện hơn 70% số lao phối AFB(+) mới ƣớc tính và điều trị lành 85% số bệnh nhân lao. Đây là mục tiêu tiến đến kiểm soát bệnh lao trên toàn thế giới vào năm 2005 do WHO khởi xƣớng từ năm 1999 [2]. Cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới, nƣớc ta cũng đang phải đối mặt với nhiều khó khăn , thách thức nhằm duy trì tính bền vững của các hoạt động chống lao,cũng nhƣ thành tựu đã đạt đƣợc. Chủ đề Ngày thế giới phòng chống lao năm nay đƣợc WHO đƣa ra là :"Đổi mớ i để kiể m soá t tố t hơn bệ nh lao", trong đó đặ c biệ t nhấ n mạ nh tớ i việ c đổ i mớ i về các cộng cụ chẩn đ oán điều trị và phòng bệnh tốt hơn ; đổ i mớ i phƣơng phá p tiế p cậ n để nhiề u ngƣờ i đƣợ c phá t hiệ n, điề u trị và đổ i mớ i về huy độ ng cá c đố i tá c cù ng tham gia phò ng , chố ng bệ nh lao Hƣở ng ƣ́ ng chủ đề nà y , tại Việt Nam , đã tiế n hành triển khai chiến dịch truyền thông nhân ngày 24/3: "Đổi mới tƣ duy của mỗi ngƣờ i để kiể m soá t bệ nh lao tố t hơn". Thiế t nghĩ đây cũ ng chính là hƣớ ng giả i phá p thích hợp và hiệu quả nhất trong bối cảnh hiện nay c ủa nƣớc ta để góp phần kiểm soát và khống chế căn bệnh nguy hiểm này . Vấn đề cố t lõ i cầ n tiế n hà nh trong thờ i điể m hiệ n tạ i chí nh là đổ i mớ i tƣ duy về phòng và chống bệnh lao [13]. 1.1.3.Tnh hnh lao kháng thuốc Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo là bệnh lao kháng thuốc (drug- reisistant tuberculosis) đang lan nhanh hơn là các nhà chuyên gia y tế dự đoán. Tại một số quốc gia tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lao kháng thuốc đã lên tới con số chƣa từng có là 20%. Bác sĩ Mario Raviglione, giám đốc WHO nói "Cách đây 10 năm, không ai nghĩ tới con số cao nhƣ vậy. Điều này chứng tỏ là chúng ta tiếp tục phạm sai lầm trong việc điều trị bệnh lao" [3]. Cho tới mãi 50 năm trƣớc loài ngƣời mới tìm ra thuốc chữa lao. Giờ đây các dòng lao kháng thuốc đã xuất hiện và có 1,7% số ca mắc bệnh trên thế giới là các ca kháng đa thuốc (MDR). Năm 2006, dòng lao kháng thuốc cực mạnh (XDR) bắt đầu xuất hiện. Chủng lao XDR này không chỉ kháng những thuốc ở tuyến đầu Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 mà còn kháng ít nhất 3 loại thuốc ở tuyến 2- tuyến phòng thủ cuối cùng chống vi trùng lao, vốn gây độc hại nhiều hơn cho bệnh nhân cùng với thời gian điều trị và chi phí đắt đỏ. Sự lây lan của lao kháng thuốc cực mạnh đƣợc tiếp sức bởi đại dich HIV, hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng yếu kém, và sự sao lãng biện pháp kiểm soát lây nhiễm [7]. Theo ƣớc tính của WHO, trên thế giới có khoảng 424.203 ngƣời bị mắc MDR, chiếm số lƣợng lớn nhất là khu vực Tây Thái Bình Dƣơng 152.203 trƣờng hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau là khu vực Đông Âu và Châu Phi. Một số nƣớc có tỷ lệ MDR ở những bệnh nhân lao mới rất cao là: Cộng hòa Dominica, Ecuador, Bờ biển Ngà, Latvia, Uzbekistan, Trung quốc, Iran, Israel [6]. Từ nhiều năm nay, Tổ chức Y tế Thế giới đã định nghĩa bệnh lao kháng đa thuốc (MDR-TB: Multi Drug Resistace- Tuberculosis) là vi khuẩn lao đã kháng lại isoniazid (rimifon) và rifampicin (đây là những thuốc trong số các thuốc chống lao hàng đầu gồm: isoniazid (H), rifampicin (R), ethamintol (E) và streptomicin (S). Giờ đây WHO lại đƣa ra khái niệm bệnh lao cực kháng thuốc (XDR-TB: Extreme Drug Resistance- Tuberculosis) là vi khuẩn đã kháng lại isoniazid, rifampicin và từ 3 thuốc thuốc chống lao hàng thứ 2 trở nên gồm : kanamycin, ofloxacin, cycloserin, PAS có nghĩa là XDR-TB = MDR-TB > 3 thuốc hàng thứ 2 [14]. Trƣớc tình hình XDR ngày càng trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và trung tâm kiểm soát bệnh Hoa Kỳ đã tiến hành phân tích 17.690 mẫu đàm đƣợc gửi từ 40 quốc gia trên toàn thế giới. Kết quả phân tích cho thấy có 20% trƣờng hợp là MDR và 2% là XDR. Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng (trong đó có Việt Nam) thì MDR là 4,2% ở bệnh nhân lao mới và 26% các trƣờng hợp có tiền căn trị lao [6]. Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nƣớc và khu vực trên thế giới, theo công bố này tỷ lệ kháng thuốc tiền phát trung bình với riêng từng loại thuốc có khác nhau, cụ thể là: kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, ethambutol 0,3%, streptomycin 2,5%. Tỷ lệ kháng [...]... xác cho vi c phát hiện các chủng M tuberculosis kháng isoniazid 1.5.3 Gen inhA với cơ chế kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao Gen inhA là một đoạn DNA có kích thƣớc 810 bp, nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao Ngƣời ta nhận thấy có khoảng 70 - 80% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này [24], [29] InhA cũng là một enzyme enoyl - acyl reductase Enzyme này hoạt hóa isoniazid. .. chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tƣơng ứng Để xác định đột biến trên gen katG và gen inhA hiện có nhiều phƣơng pháp, song giải trình tự gen vẫn là phƣơng pháp cơ bản, chính xác, rõ ràng nhất [35] Để giải trình tự gen katG và gen inhA, hiện nay có thể thực hiện trực tiếp từ sản phẩm PCR Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho vi c... 1.5.2 Gen katG với cơ chế kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao Gen katG là một đoạn DNA có kích thƣớc 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase Ngƣời ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này [20] Gen katG mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase Enzyme này hoạt hóa isoniazid bằng cách... khuẩn lao kháng thuốc trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay gồm có 2 phƣơng pháp đó là phƣơng pháp xác định kiểu hình và phƣơng páp xác định kiểu gen 1.4.1 Các phương pháp xác định kiểu hình Các phƣơng pháp xác định kiểu hình thông thƣờng có thể là: Phƣơng pháp xác định tƣơng quan, phƣơng pháp xác định tỷ lệ kháng, phƣơng pháp nồng độ tuyệt đối Các phƣơng pháp mới trong xác định kiểu hình... ra đột biến là 581 bp trên gen inhA do có sự thay thế nucleotide ATC → ACC Hình 1.4 Cơ chế kháng thuốc isoniazid của gen inhA [37] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lao này đƣợc phân lập từ mẫu đờm của các bệnh nhân lao ở bệnh vi n Trung. .. Nguyên 23 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương Thiết kế mồi DNA vi khuẩn lao PCR Gắn gen katG vào plasmid pBT gen katG Amp katG Đọc trình tự Amp So sánh và phân tích kết quả nhận đƣợc Xác định vị trí đột biến Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Kỹ thuật tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn lao Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện tại Học vi n Quân Y: DNA từ mẫu đờm của bệnh... lực của gen inhA và NADH, do đó enzyme này sẽ không hoạt hóa isoniazid mà tạo ra acid mycolic vì vậy tế bào vi khuẩn lao sẽ kháng thuốc isoniazid (Hình 1.4).Vì vậy, vi c phát hiện sự thay đổi di truyền trên gen inhA có thể cung cấp một phƣơng pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho vi c phát hiện các chủng M.tuberculosis kháng isoniazid [29] Ứng dụng phƣơng pháp SHPT để xác định đột biến trên gen inhA Vị... bị biến đổi do đó không còn khả năng diệt khuẩn + Sản phẩm gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc chống lao đƣợc vi khuẩn lao sản xuất thừa ra + Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt nồng độ tối thiểu để có thể diệt khuẩn 1.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán lao kháng thuốc Chẩn đoán vi khuẩn lao. .. trình tự, tự động tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ gen - Vi n Công nghệ Sinh học + Phân tích kết quả: - Kiểm tra kết quả thu đƣợc bằng phần mềm máy tính ABI3130 - Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen, thiết lập chủng wild type để so sánh - Xử lý, phân tích các trình tự gen katG và gen inhA có kích thƣớc khoảng 684bp và 501bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chƣơng trình phân tích chuỗi... để chẩn đoán quá dài, ít nhất mất 2 - 4 tuần Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao kháng thuốc còn gặp nhiều khó khăn [21] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương 1.4.2 Các phương pháp xác định kiểu gen Hiện nay có nhiều phƣơng pháp xác định kiểu gen đƣợc ứng dụng để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, . PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VI T NAM . chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Miền Trung - Vi t Nam ". 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát. NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG – VI T NAM Chuyên