Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM    NGUYỄN TIẾN DŨNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM    NGUYỄN TIẾN DŨNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S. Nguyễn Văn Đồng PGS.TS. Ngô Xuân Bình Thái Nguyên-2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008 5 Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau 6 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 7 Bảng 1.4. Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 17 Bảng 1.5 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa 20 Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy 38 Bảng 3.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương sau 10 ngày 45 Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 47 Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen 48 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen 53 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm 54 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen 56 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen 57 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen 58 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen 59 Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tương 62 Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tương 63 Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin 10 Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật 12 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 15 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 16 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H 31 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương 35 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương 37 Hình 3.1. Phát sinh tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu 46 Hình 3.2. Phát sinh rễ của một số giống đậu tương 48 Hình 3.3. Biểu hiện gus ở đậu tương khi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn 49 Hình 3.4. Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp trong Agrobacterium chủng AGL1 51 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp 52 Hình 3.6. Chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM . 60 Hình 3.7. Biểu hiện của gen gfp được chuyển vào các giống đậu tương 63 Hình 3.8. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng đậu tương 64 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR . 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : 6 - Benzylaminopurine bp : base pair (cặp bazơ) GFP : Green Fluorescent Protein DNA : Deoxyribo Nucleic Acid EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br : Ethidium Bromide gus : -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) hpt : Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase MSC : Multi - Cloning Site NAA : α -Napthalene acetic acid MS : Murashige and Skoog, 1962 LB : Luria Bertani NOS : Nopalin Sythetase OD : Optical Density (mật độ quang học) PCR : Polymerase Chain Reaction SDS : Sodium Dodecyl Sulfate TAE : Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-EDTA T- DNA : Transfer DNA (ADN chuyển) Ti-Plasmid : Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR : Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u) X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid 2,4-D : Dichlorophenoxy acetic acid & cs : và cộng sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Yêu cầu nghiên cứu 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng 3 1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương 3 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam 6 1.3.1.Trên thế giới 6 1.3.2. Ở Việt Nam 7 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen 9 1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên 9 1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9 1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA 11 1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen 11 1.4.5. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật 13 1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 1.5.1. Vector nhị thể 14 1.5.2. Hệ vector liên hợp 16 1.6. Gen chỉ thị 17 1.6.1. Chỉ thị chọn lọc 17 1.6.2 Chỉ thị sàng lọc 18 1.7. Hệ thống tái sinh và biến nạp gen ở giống đậu tƣơng 20 1.7.1. Hệ thống tái sinh ở đậu tương 20 1.7.2. Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. VẬT LIỆU 30 2.1.1. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 30 2.1.2. Hóa chất 30 2.1.3. Plasmid, primers và vi khuẩn 30 2.1.4. Vật liệu thực vật 31 2.1.5. Địa điểm nghiên cứu 32 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32 2.3. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu 32 2.3.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 32 2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng pháp xung điện 33 2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 33 2.3.4. Phƣơng pháp PCR 34 2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose 2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh 35 2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng 39 2.3.8 Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen 39 2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị GFP 39 2.3.8.2. Phân tích PCR 39 2.3.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và sử lý kết quả 41 2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………… 41 2.3.9.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá .42 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu tƣơng 44 3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương 44 3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương nghiên cứu 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tƣơng . 48 3.3. Kết quả biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng 51 3.4. Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen 52 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lây nhiễm 52 3.4.2. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm 54 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen 55 3.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringon (AS) 56 3.4.5. Ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng biến nạp 57 3.4.6. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen 59 3.5. Đánh giá hiệu quả chuyển gen của một số giống đậu tƣơng 61 3.5.1. Hiệu quả chuyển gen thông qua gen chỉ thị sàng lọc gfp 61 3.5.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen. 63 LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 [...]... (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen vào một số giống đậu tương của Vi t Nam 3 Yêu cầu nghiên cứu - Lựa chọn giống đậu tương làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen - Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen ở đậu tương - Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector... quả nghiên cứu cây chuyển gen của Vi t Nam như đậu tương [7], [8], ngô [4] Tuy nhiên đó mới chỉ là các kết quả nghiên cứu ban đầu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Vi c tạo giống đậu tương biến đổi gen đòi hỏi phải nghiên cứu một cách có hệ thống Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiến hành: Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thông. .. pháp biến nạp gen ở đậu tương  Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium Đây là phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium như một vector sinh học để biến nạp một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo được cây biến đổi gen [60], [125] Agrobacterium xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thương Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi khuẩn. .. Luciferase (vibrio spp.) 1.7 Hệ thống tái sinh và biến nạp gen ở giống đậu tƣơng 1.7.1 Hệ thống tái sinh ở đậu tương Hầu hết những nghiên cứu về đậu tương trong các phòng thí nghiệm hiện nay trên thế giới đều hướng tới cải thiện đặc tính của đậu tương bằng chuyển nạp gen Hệ thống tái sinh cây đậu tương được phát triển chủ yếu nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu này  Tái sinh cây thông qua phát sinh... và đậu tương nói riêng Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện tích trong cơ cấu luân canh thì vi c tăng năng suất là giải pháp chính Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong ngành sản xuất đậu tương của thế giới hiện nay Ở nước ta, đậu tương, ngô và bông là 3 cây trồng đang được nghiên cứu để tạo cây chuyển gen Một số phòng thí nghiệm của các Vi n nghiên cứu. .. giống đậu tương của Vi t Nam [5] Các tác giả khác đã nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [9], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103; phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương. .. gieo trồng của đậu tương 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng 1.4.1 Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối... sung vào trong môi trường tái sinh Gần đây vi khuẩn Agrobacterium và nốt lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại vius rây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương [38] Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu Phân tích Southern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào. .. nhiễm sắc thể của Agrobacterium tumefaciens qui định và protein trong tế bào thực vật 1.5 Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 1.5.1 Vector nhị thể Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không nằm trên cùng một plasmid với vùng T – DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T – DNA vào hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector... được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L.) Merrill và loài hoang dại hàng năm G Soja Sieb và Zucc Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L.) Merrill [2], [67] 1.2 Đặc tính chống chịu của cây đậu tương  Đặc tính chịu hạn Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu . tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L. ) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S. Nguyễn Văn. Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens . 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen vào một số giống đậu tương của Vi t Nam 3. Yêu cầu nghiên cứu - Lựa chọn giống đậu tương. 2 Vi c tạo giống đậu tương biến đổi gen đòi hỏi phải nghiên cứu một cách có hệ thống. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiến hành: Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (Glycine max (L. ) Merrill)