ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  HOÀNG THỊ KHÁNH HỒNG BIỂU HIỆN VÀ TIẾT ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP Ở BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ THÚY ÁI THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012 Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI 3 1.1.1. Khái niệm về huyết khối 3 1.1.2. Tình hình nghẽn mạch do huyết khối 3 1.1.3. Cơ chế hình thành huyết khối 4 1.1.4. Sự phân hủy huyết khối bởi enzym nội sinh plasmin 8 1.1.5. Các nhân tố trong điều trị bệnh nghẽn mạch do huyết khối 9 1.2. NATTOKINASE 12 1.2.1. Nguồn gốc, đặc tính của Nattokinase 12 1.2.2. Cơ chế phân hủy fibrin của Nattokinase 14 1.2.3. Sinh tổng hợp và sản xuất Nattokinase 15 1.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp trong và ngoài nước 17 1.3. CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 19 1.3.1. Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ E. coli và Bacillus subtilis 19 1.3.2. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector sát nhập 20 1.3.3. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector plasmid có khả năng tự sao chép 25 1.4. HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS 27 Luận văn Thạc sĩ Sinh học CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 29 2.1.1. Dụng cụ 29 2.1.2. Thiết bị 29 2.1.3. Hóa chất 30 2.1.4. Môi trường 33 2.1.5. Vật liệu sinh học 34 2.2. PHƯƠNG PHÁP 37 2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37 2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38 2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38 2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39 2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40 2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40 2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41 2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43 2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46 2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp E. coli DH5 48 2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49 2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B. subtilis 49 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa gen aprE 50 2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE 52 2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53 2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54 2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54 2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO 56 3.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN 59 3.2.1. Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. phân lập từ Natto 59 3.2.2. Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60 3.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli mang gen aprE 61 3.2.3.1. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE 61 3.2.3.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE bằng phương pháp PCR 61 3.2.3.3. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE bằng phương pháp cắt bằng enzym cắt hạn chế 63 3.2.3.4. Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase 64 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 3.3. DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU HIỆN Ở BACILLUS 68 3.3.1. Hệ thống biểu hiện pAX01 68 3.3.2. Hệ thống biểu hiện pBG01 72 3.4. TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74 3.4.1. Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào bộ gen các chủng Bacillus subtilis 75 3.4.2. Dòng hóa casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pgrac vào bộ gen các chủng Bacillus subtilis DB104 78 3.5. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE 80 3.5.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80 3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83 3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85 3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85 3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86 CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 88 4.2. ĐỀ NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC 93 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - i - DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Amp APC bp dH 2 O dNTP DNA EDTA EGTA Ery GRAS Kb kDa LB LS MCS Neo OD PAI-1 pB PCR Rnase SD Amp icillin Activated Protein C base pair distilled water DeoxyriboNucleotide Triphosphate DeoxyriboNucleic Acid Ethylene Diamine TetraAcetic Acid Ethylene Glycol Tetraacetic Acid Erythromycin Generally recognized as safe organism Kilobaze kilo Dalton Luria – Bertani Linsmaier - Skoog Multicloning site Neomycin Optical Density Plasminogen Activator Inhibitor 1 pBluescript II KS (+) Polymerase chain reaction RiboNuclease Shine - Dalgarno Kháng sinh ampicillin Protein hoạt hóa C Cặp baze Nước cất Các loại axít nucleotid Axít deoxyribonucleic Kháng sinh erythromycin Vi sinh vật an toàn Trọng lượng kDa Môi trường LB Môi trường LS Vị trí tạo dòng Kháng sinh neomycin Mật độ quang học Chất kìm hãm hoạt hóa plasminogen Plasmid pB Phản ứng PCR Enzym Rnase Trình tự gắn ribosom Luận văn Thạc sĩ Sinh học - ii - SDS SDS- PAGE SK Spec TE tPA TAE u-PA X-gal S odium D odecyl S ulphate SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Streptokinase Spectinomycin Tris-EDTA tissue Plasminogen Activator Tris-Acetic acid- EDTA urokinase Plasminogen Activator 5-bromo-4 chloro-3 indolyl-beta-D- glactoside Dung dịch SDS Điện di SDS-PAGE Thuốc chống đông máu Kháng sinh spectinomycin Dung dịch TE Chất hoạt hóa plasminogen mô Dung dịch đệm chạy điện di TAE Chất hoạt hóa plasminogen urokinase Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iii - DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu 6 Bảng 2.1. Thành phần môi trường HS 33 Bảng 2.2. Thành phần môi trường LS 34 Bảng 2.3. Các trình tự mồi được sử dụng trong luận văn 36 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR 39 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV 42 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối pB và aprE 43 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE bằng BamHI . 43 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI 45 Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII 45 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng nối 45 Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng BamHI và XbaI 47 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng nối 47 Bảng 3.1. So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus 87 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iv - DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cơ chê hình thành huyết khối 5 Hình 1.2. Sự hoạt hóa và tác động lẫn nhau của các yếu tố đông máu 7 Hình 1.3. Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo 9 Hình 1.4. Sản phẩm Natto 13 Hình 1.5. Cơ chế phân giải fibrin in-vivo bởi Nattokinase 14 Hình 1.6. Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA được sử dụng trong luận văn 23 Hình 1.7. Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng tại locus lacA . 24 Hình 1.8. Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 được sử dụng trong luận văn 26 Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35 Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37 Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40 Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57 Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto . 58 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng phân lập sau 6 giờ ủ 59 Hình 3.4. DNA bộ gen chủng Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% . 60 Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5  có mang pB-aprE bằng phản ứng PCR 62 Hình 3.6. Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E. coli DH5  có mang pB-aprE tương ứng bằng phản ứng PCR, bản mẫu là các plasmid . 63 Luận văn Thạc sĩ Sinh học - v - Hình 3.7. Kết quả đại diện chọn dòng tế bào E. coli DH5  có mang pB- aprE bằng enzym cắt hạn chế BamHI 64 Hình 3.8. Trình tự peptide trưởng thành gồm 275 amino acid ở Nattokinase 65 Hình 3.9. So sánh một phần trình tự nucleotide gen aprE của chủng phân lập với trình tự chuẩn 66 Hình 3.10. Trình tự codon mã hóa gen aprE khuyết cytosine tại vị trí 437 66 Hình 3.11a. Trình tự gen aprE của chủng B2 cho thấy có sự khác biệt 9 nucleotide so với aprE công bố 67 Hình 3.11b. Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với Nattokinase cho thấy khác biệt ở vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 ở peptide trưởng thành) 68 Hình 3.12. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 1012, DB104 69 Hình 3.13. Kết quả dòng hóa ở E. coli DH5  70 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi pAX01- F/aprE-R. 71 Hình 3.15. Plasmid tái tổ hợp cắt với EcoRV. 71 Hình 3.16. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 . 72 Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprE- F/pMTL-R. 73 Hình 3.18. Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE cắt với HindIII 74 Hình 3.19. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis 1012 khả nạp trên 2 đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh . 76 Hình 3.20. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R 77 [...]... 12.000 vòng/phút trong 1 phút - Thu dịch và bảo quản sản phẩm ở -20oC 2.2.12 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B subtilis Hai chủng Bacillus subtilis được sử dụng làm tế bào khả nạp và biểu hiện gen là B subtilis 1012, B subtilis DB104 a) Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis - Nuôi cấy lắc chủng Bacillus subtilis trong ống nghiệm 5ml môi trường... plasmid tái tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R 80 Hình 3.25 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau nuôi cấy 81 Hình 3.26 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy chủng B subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82 Hình 3.27 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy chủng B subtilis. .. nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR  Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector khác nhau ở Escherichia coli  Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104  Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp -2- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Vật liệu và phương pháp... cấy chủng B subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi PSgrac 84 Hình 3.28 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi PSgrac 85 Hình 3.29 Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B subtilis DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86 - vi - Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU Luận văn Thạc sĩ Sinh... tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp bằng vector pAX01 + Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprED3] (Bacillus Gentics Stock Centre at Ohio) được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector pAX01 và pBG01 b) Plasmid - Plasmid pBluescript II KS (+) được sử dụng làm vector dòng hóa, mang gen kháng kháng sinh AmpR, gen lacZ mã hóa cho 146 acid amin đầu N của enzym galactosidase,... cho protein Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+), kí hiệu pB Đoạn gen aprE được dòng hóa vào vector pB theo chiến lược tạo dòng đầu bằng Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E coli DH5 nhằm lưu trữ plasmid tái tổ hợp in vivo Các bước thực hiện như sau: - Cắt mở vòng plasmid pB bằng EcoRV - Tinh chế sản phẩm cắt bằng bộ kít tinh chế DNA - Đoạn DNA của gen mã hóa cho enzym Nattokinase. .. trong nước Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:  Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản... kiểm tra cấu trúc plasmid bằng enzym cắt hạn chế EcoRV Gen mã hóa được giải trình tự và phân tích sự đa dạng Đoạn gen aprE được dòng hóa vào plasmid pAX01 theo chiến lược tạo dòng đầu so le Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E coli DH5Các bước thực hiện như sau: - Plasmid pAX01 sau khi tách chiết và kiểm tra bằng điện di sẽ được cắt bằng hai enzym BamHI và SacII không đồng thời cùng lúc... DNA của gen mã hóa cho enzym Nattokinase được nối vào plasmid pB đã chuẩn bị ở trên để tạo plasmid tái tổ hợp - 41 - Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - Hóa biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bào khả nạp E coli DH5 - Trải hỗn hợp hóa biến nạp lên môi trường LB-Amp100 có bổ sung X-gal - Chọn khuẩn lạc màu trắng làm khuẩn lạc dự tuyển - Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi T3, T7,... hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5 2.2.9 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 Gen aprE được nối với plasmid pBG01 tại vị trí enzym cắt hạn chế BamHI và XbaI, và biến nạp vào E coli bằng hóa biến nạp Các dòng E coli mang vector có gen chèn được sàng lọc bằng nuôi cấy trên môi trường LB có ampicillin 100µg/ml và bằng phản . Nattokinase tái tổ hợp nội b o ở Bacillus subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát b i P Sgrac 85 Hình 3.29. Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại b o ở chủng B. subtilis DB104 mang pBG01-aprE. Hệ thống biểu hiện pBG01 72 3.4. TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74 3.4.1. Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào b gen các. b o Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE 52 2.2.15. Biểu hiện gen aprE b ng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53 2.2.16. Biểu hiện gen aprE b ng hệ thống pBG01