LOGO Chương 2. ĐIỀU KIỆN KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TÉ BÀO THỰC VẬT *PowerPoint 2002 and up required to use the template. Các nội dung chính  2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng  2.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật  2.1.2 Khử trùng  2.1.2.1 Khử trùng phòng cấy và tủ cấy  2.1.2.2 Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác  2.1.2.3 Khử trùng mẫu cấy thực vật  2.2.1 Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật  2.2.1.1 Các chất khoáng  2.2.1.2 Các nguyên tố đa lượng  2.2.1.3 Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )  2.2.1.4 Các vitamin  2.2.1.5 Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô  2.2.1.6 Các chất điều hoà sinh trưởng  2.2.1.7 Các chất kháng sinh  2.2.2. Các chất khử trùng  2.3 Độ pH môi trường  2.4 Các tác nhân làm rắn môi trường  2.5 Một số loại môi trường cơ bản  2.6 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô  2.6.1 Các thiết bị , dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô  2.6.1.1 Phòng rửa và cất nước:  2.6.1.2 Phòng sấy hấp:  2.6.1.3 Phòng chuẩn bị môi trường:  2.6.1.4 Phòng cấy vô trùng  2.6.1.5 Phòng nuôi mẫu cấy:  2.6.1.6 Phòng sinh hóa : Đảm bảo điều kiện vô trùng  2.1.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật - mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt Đảm bảo điều kiện vô trùng  2.1.2 Khử trùng  2.1.2.1 Khử trùng phòng cấy và tủ cấy Hơi formon Đèn cực tím Đảm bảo điều kiện vô trùng  2.1.2.2 Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác Dụng cụ: -Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng -vô trùng bằng cách sấy ở 160 0 C/giờ -nhúng vào cồn 95 0 và đốt trên ngọn lửa đèn cồn Nút đậy: -bông không thấm nước -nhựa chịu nhiệt có thể hấp ở 120 0 C mà không bị biến dạng Môi trường -môi trường khoáng được hấp tiệt trùng ở 1210C, 1 atm -phin lọc micropore Đảm bảo điều kiện vô trùng  2.1.2.3 Khử trùng mẫu cấy thực vật  Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là:  Đỉnh sinh trưởng thân, rễ  Chồi bên  Tượng tầng  Vảy củ  Chồi ngọn  Nhu mô lá, nhu mô vỏ thân  Chồi nảy từ củ Bảng 2.2. Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử lí mô cấy thực vật Stt Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử trùng (phút) Hiệu quả 1 Hypochlorite calcium 9-10% 5-30 Rất tốt 2 Hypochlorite sodium 0,5-5% 5-50 Rất tốt 3 Nước bromine 1-2% 2-10 Rất tốt 4 Oxy già 3-12% 5-15 Tốt 5 Chlorua thủy ngân 0,1-1% 2-10 Tốt 6 Nitrate bạc 1% 5-30 Tốt 7 Kháng sinh 4-50mg/l 30-60 khá Quy trình khử trùng bề mặt  1. Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịch khử trùng.  2. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10 - 30 phút.  3. Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng.  4. Chắt dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng. [...]... Potassium – cần thiết cho phân chia tế bào, mô phân sinh, tham gia chu trình C, Protein và quang tổng hợp  K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước... thành tế bào, phát triển lá và rễ Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids  Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin g Magiê (Mg): Magnesium – tham gia qt quang tự dưỡng và hệ thống hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và tinh bột  Môi trường nuôi cấy mô thực vật. .. sang phot phat hữu cơ  Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO42- Molydate thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 mm g Kẽm (Zn):  kẽm là một thành phần trong enzim có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA là trytophan Nồng độ của kẽm bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy thay đổi từ 0,1-70 mm, như vậy sự dư kẽm trong môi trường nuôi cấy ít gây độc cho mô 2.2.1.2 Các vitamin... thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hóa trị 1 và 2 Nồng độ đồng cao sẽ gây độc cho mô Hầu hết các môi trường nuôi cấy có Cu2+ với hàm lượng 0,1-10 mm Các ion đồng được bổ sung vào dưới dạng sulfate đồng, đôi khi người ta cũng có thể bổ sung đồng dưới dạng CuCl 2 hoặc CuNO3 d Mangan (Mn):  Manganese là một trong những nguyên tố vi lượng quan trọng nhất, gần như luôn có mặt trong môi trường nuôi cấy. .. trường nuôi cấy Nồng độ của Mn trong môi trường tương đương với Fe và B Mn có tác động hóa học tương tự như Mg+ nên có thể thay thế cho Mg+ trong một số hệ thống enzim Manganese – tạo mối quan hệ giữa các enzymes và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ quang tổng hợp và hô hấp e Coban (Co):  Cobalt có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nồng độ sử dụng là 1 mm, đôi khi... (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả năng quang hợp  nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12%  lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose,... vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol  Adenine – thành phần của RNA và DNA  Inositol – thành phần của B complex, trong thể photphate là 1 phần của màng tế bào, bào quan  Thiamine – bản chất như là 1 coenzyme trong chu trình citric acid 2.2.1.3 Các chất bổ sung vào môi trường cấy mô  a Amino acid và các nguồn cung... độc từ mô nuôi cấy Nồng độ hay dùng là 0,3% hoặc thấp hơn  Than sử dụng cho nuôi cấy mô  Khử sạch acid và phải trung tính  Không sử dụng lại c Nước dừa  Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây  Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 % (v/v) d Bột chuối  Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy mô một số... vô cơ cho thực vật để tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp  Nitrogen – ảnh hưởng chỉ số phát triển của cây, đặc biệt trong quá trình phát triển của nhân, protein, diệp lục, amino acid và các hocmon  Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu c Phospho (P):  Phosphorus – có nhiều trong đỉnh sinh trưởng, các mô phát triển... nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzym  - Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym 2.2.1.1.1 Các nguyên tố đa lượng      NH4NO3 KNO3 CaCl2 -2 H2O MgSO4 -7 H2O KH2PO4 . bào thực vật  2. 2.1.1 Các ch t khoáng  2. 2.1 .2 Các nguyên tố đa lượng  2. 2.1 .3 Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn )  2. 2.1.4 Các vitamin  2. 2.1.5 Các ch t bổ sung vào. trường cấy mô  2. 2.1.6 Các ch t điều hoà sinh trưởng  2. 2.1.7 Các ch t kháng sinh  2. 2 .2. Các ch t khử trùng  2. 3 Độ pH môi trường  2. 4 Các tác nhân làm rắn môi trường  2. 5 Một số loại. và tế bào thực vật  2. 1 .2 Khử trùng  2. 1 .2. 1 Khử trùng phòng cấy và tủ cấy  2. 1 .2. 2 Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác  2. 1 .2. 3 Khử trùng mẫu cấy thực vật  2. 2.1 Thành phần hoá học