Đang tải... (xem toàn văn)
Bảo quản đông lạnh là kĩ thuật trữ tế bào và mô sống ở điều kiện nhiệt đ ộ thấp trong một th ời gian rất dài. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (196 0 C), hầu hết mọi ph ản ứng hoá học đều không xảy ra, tất cả hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại. Các phân tử nước lúc này tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự tổn hại nào cho tế bào được trữ. Theo cách này thì tế bào và mô có thể hồi phục sự phát triển bất cứ khi nào con người cần sử dụng. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng tới tế bào là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên, trên thực tế yếu tố này không quan trọng. Một số nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi giải đông, chuột con sinh ra không có dị tật b ẩm sinh nào.
1 CHƯƠNG 8 KĨ THUẬT BẢO QUẢN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ThS. Đặng Thị Tùng Loan PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Tp.HCM I. GIỚI THIỆU 1. Khái niệm Bảo quản đông lạnh là kĩ thuật trữ tế bào và mô sống ở điều kiện nhiệt độ thấp trong một thời gian rất dài. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196 0 C), hầu hết mọi phản ứng hoá học đều không xảy ra, tất cả hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại. Các phân tử nước lúc này tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự tổn hại nào cho tế bào được trữ. Theo cách này thì tế bào và mô có thể hồi phục sự phát triển bất cứ khi nào con người cần sử dụng. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng tới tế bào là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên, trên thực tế yếu tố này không quan trọng. Một số nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi giải đông, chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào. 2. Mục đích (1) Giảm thiểu sự biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền. (2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào. (3) Ngăn cản quá trình biệt hoá tế bào. (4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào. (5) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong in vitro. (6) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái. (7) Giảm chi phí nuôi cấy. (8) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng. (9) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen. (10) Thuận lợi cho vận chuyển. (11) Thuận lợi cho việc thương mại hoá. (12) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức. II. SINH HỌC ĐÔNG LẠNH 1. Cơ sở khoa học của bảo quản đông lạnh 1.1. Các biến đổi của tế bào trong bảo quản bằng phương pháp đông lạnh 1.1.1. Sự hình thành tinh thể nước đá Khi nhiệt độ hạ thấp, sự xuất hiện những tinh thể nước đá đầu tiên là dấu hiệu bắt đầu của sự biến đổi giai đoạn. Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ bên trong tế bào bằng với độ hạ băng điểm của dung dịch mà băng điểm của dung dịch này lại phụ thuộc vào nồng độ của chất hòa tan. Tuy nhiên, nồng độ bên trong tế bào đậm đặc hơn bên ngoài tế bào nên sự biến đổi giai đoạn ở bên trong tế bào được xảy ra ở một nhiệt độ thấp hơn ở bên ngoài tế bào. Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường ngoài tế bào, vì vậy nồng độ chất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động ra ngoài tế bào và dung tích tế bào giảm. Tốc độ mất nước của tế bào lại phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh. Ở trên tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả năng tạo băng đá nội bào tăng; những tinh thể nước đá tăng kích thước và do đó, sự tổn hại tế bào cũng nhiều hơn. Ngược lại, ở dưới tốc độ giới hạn, sự sống của tế bào giảm do nồng độ của chất hoà tan nội bào tăng lên. Người ta nhận thấy trong môi trường huyền phù, nước biến đổi chậm hơn và sự mất nước nội bào được duy trì sao cho có sự cân bằng thẩm thấu với môi trường bên ngoài, do 2 đó sẽ gây tổn hại tế bào ít hơn. Sự có mặt của băng đá nội bào và “hiệu ứng của dung dịch” là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, quyết định khả năng sống của tế bào. Sự hoạt động phối hợp của 4 yếu tố sau đây quyết định hình dạng tinh thể nước đá được tạo thành trong quá trình đông lạnh: Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn Tốc độ làm lạnh Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch Nồng độ dung dịch Hình 1. Sự hình thành tinh thể đá Ở môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đá thường hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15 o C. Tuy nhiên, đá chỉ tạo thành tự nhiên ở nhiệt độ - 10 o C. Ở nhiệt độ -5 đến -10 o C cần có điều kiện kết hợp. Đó là sự tham gia của một phần nhỏ chất rắn (ví dụ như hạt bụi hoặc tinh thể đá nhân tạo). Sự tạo đá càng tăng khi nhiệt độ càng giảm. Ở nhiệt độ khoảng -130 o C, tất cả chất liệu không còn ở dạng lỏng mà đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Đây là hiện tượng kết tinh hóa hay còn được gọi là thủy tinh hóa. Hiện tượng này xảy ra do môi trường có pha chất hoà tan cũng như chất bảo quản đông lạnh có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường. Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan. 3 A B Hình 2. Sự biến đổi vật lý của tế bào khi đông lạnh A. Không có chất bảo quản lạnh, B. Có chất bảo quản lạnh Sự tăng thêm nồng độ của các chất hoà tan trong môi trường đông lạnh ảnh hưởng đến việc hình thành những tinh thể nước đá. Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượng nước ở thể lỏng giảm đi. Do đó, nồng độ các chất hoà tan tăng lên gây mất cân bằng về áp suất thẩm thấu, kéo nước bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng tế bào. Việc tăng nhiệt độ tiềm năng cũng là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Phân tử nước khi chuyển từ thể lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra một nhiệt lượng. Nếu nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0 o C. Thay đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau khi giải đông. 1.1.2. Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh Nhiệt độ chính xác để kết tinh và thủy tinh hóa hoàn toàn phụ thuộc vào phức hợp có trong nước. Trong dung dịch NaCl có cùng một áp suất, hiện tượng thủy tinh hóa xảy ra ở nhiệt độ -20 o C đến -30 o . Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti. Vì vậy, trước khi đạt đến điểm này NaCl vẫn ở dạng dung dịch. Số lượng phân tử nước có ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt độ, kết quả trực tiếp là giảm độ thẩm thấu của môi trường, môi trường trở nên ưu trương. Hình 3. Khi nhiệt độ của dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm đông, hiện tượng kết tinh đá và nồng độ NaCl tăng lên Làm lạnh ở nhiệt độ xấp xỉ 0 o C làm giảm sự khuếch tán một chiều của protein màng. Ở những nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng độ muối cao, nhất là trong quá trình đông lạnh chậm. Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự co thể tích trong quá trình mất nước. Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ các ion tăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy cảm với các stress trong quá trình đông lạnh khi nhiệt độ giảm (choc thermique) hoặc khi pha loãng môi trường (choc de la dilution) trong quá trình giải đông. 1.1.3. Tốc độ khử nước 4 Tốc độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Các yếu tố này thay đổi khác nhau tùy theo từng loại tế bào và vì vậy đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình bảo quản đông lạnh ở điều kiện tốt nhất. Các yếu tố liên quan là tính thấm nước của màng tế bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước này (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích của tế bào (SA/V). Bằng cách đo tỉ lệ thay đổi về diện tích bề mặt tế bào và thể tích tế bào ở các độ thẩm thấu khác nhau, có thể xác định được tính thấm của màng tế bào (Lp). Diện tích bề mặt càng lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) càng lớn. Đối với hầu hết các tế bào của đông vật có vú, tính thấm của màng tế bào (Lp) có giá trị khoảng 0.43 m 3 /m 2 .phút.atmosphere. Tuy nhiên, đối với hồng cầu và tinh trùng thì tính thấm của màng tế bào (Lp) lớn hơn nhiều. Điều này có nghĩa là hồng cầu và tinh trùng mất nước nhanh hơn trong dung dịch ưu trương; do đó, tốc độ bảo quản đông lạnh tốt nhất đối với loại tế bào này là rất quan trọng. Yếu tố quan trọng thứ hai trong quá trình khử nước là năng lượng hoạt hóa cho tính thấm nước (dH*). Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả năng thấm nước. Trước đây, bằng cách đo tính thấm của màng tế bào (Lp) ở các nhiệt độ khác nhau để xác định dH* đối với trứng. Về thực hành, đây là khoảng nhiệt độ trên điểm đông lạnh. Kết quả đo được là 14.5 Kcal/mol. Giá trị này tương đối cao và nói chung, nhiệt độ cứ hạ 10 o C thì tốc độ khử nước sẽ giảm một nửa. Cuối cùng, tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích cũng góp phần quan trọng đối với tốc độ khử nước của tế bào. Nếu tỉ lệ này cao thì tế bào sẽ khử nước nhanh hơn. Hình 4. Tốc độ mất nước của tế bào trong môi trường ưu trương phụ thuộc vào nhiệt độ 1.1.4. Sự giảm thể tích thực của tế bào Sự thay đổi thể tích tế bào có thể đo được để biểu thị quá trình khử nước. Quá trình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) của tế bào. Các giá trị này phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh. Dựa trên cơ sở tính toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác định được ở các tốc độ làm lạnh khác nhau. Vì vậy, ở tốc độ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều, và thể tích tế bào không giảm nhiều như 5 ở tốc độ làm lạnh thấp. Tốc độ làm lạnh thấp sẽ làm cho tế bào mất nước. Tuy nhiên, thể tích giảm thực sự ít hơn so với tính toán, điều này có thể là do sai lầm trong phép ngoại suy đối với năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định ở nhiệt độ trên điểm đông lạnh). Hình 5. % khối lượng tế bào giảm so với khối lượng ban đầu ở các nhiệt độ khác nhau. Các đường cong tương ứng với tốc độ làm lạnh khác nhau Hình 6. % khối lượng tế bào giảm so với khối lượng ban đầu được tính (đường liền) và được ghi lại bằng thực nghiệm (dường đứt). 1.1.5. Sự giảm tốc độ hoạt động của Enzyme Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37 o C xuống còn 7 o C, hoạt động của enzyme giảm 8 lần. Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng. Từ 20 o C, tốc độ phản ứng enzyme giảm theo nhiệt độ một cách ổn định theo trình tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 10 o C (Q 10 ). Tuy nhiên, trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt độ thì sự thay đổi tốc độ phản ứng enzyme (ở nhiệt độ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein. Các chất bảo quản đông lạnh có thể đề phòng sự biến đổi này. 1.1.6. Độ pH của dung dịch Trong quá trình đông lạnh, độ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt độ, sự cân bằng acid – base của môi trường biến đổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa của các hợp chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng (salting out). Các chất bảo quản đông lạnh có thể biến đổi cân bằng acid – base của dung dịch, chẳng hạn như glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, ester hoạt động như base mạnh (DMSO chẳng hạn). Sự biến đổi độ pH của dung dịch theo nhiệt độ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản được sử dụng: với nồng độ DMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH của dung dịch PBS tăng nhanh, nhưng lại ổn định hơn với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%) độ pH của dung dịch PBS và glycerol ổn định, trong khi đó, pH dung dịch đệm Tris có sự thay đổi nổi bật. Tuy nhiên, pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ. Người ta nhận thấy rằng tế bào có thể sống sau bảo quản ở nhiệt độ xấp xỉ 0 o C với pH trên 9. 1.1.7. Sự hình thành bọt khí Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành đá. Hơn nữa, tinh thể nước đá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị đông lạnh tăng lên (tỉ trọng của đá thấp hơn tỉ trọng của nước). Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giải đông tế bào. Năm 1988, Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác động của sự hình thành đá. Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm và tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh. Số lượng bọt khí tương ứng với tốc độ làm lạnh. Bên cạnh các khí hoà tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO 2 làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường. Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng 6 hoà tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại tế bào. Trong quá trình giải đông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành không bào lớn bên trong tế bào, làm tế bào phình to. Trong thực tế, bọt khí hình thành rất nhanh, dẫn đến vỡ tế bào. Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường đông lạnh có chứa bicarbonat. Vì vậy, PBS thường được sử dụng hơn. 1.2. Thuyết hai yếu tố Căn cứ vào những quan sát thực nghiệm về mối quan hệ giữa sự sống sót của tế bào với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đã đưa ra giả thuyết hai yếu tố về những tổn thương khi đông lạnh tế bào. Hai yếu tố này đã đặt nền tảng cơ sở cho hai cơ chế khác nhau, và có thể chúng là các nguyên nhân trực tiếp, gây ra những tổn hại cho tế bào, trong suốt quá trình tiến hành đông lạnh và lưu giữ. Bảng 30.1. Khả năng phản ứng của tế bào khi gặp phải các tác nhân gây stress trong tiến trình đông lạnh Tác nhân stress Phản ứng của tế bào Giảm nhiệt độ Những biến đổi của lớp màng lipid, khử polymer hoá bộ xương tế bào Gia tăng nồng độ các chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu Tăng nồng độ ion Những phản ứng trực tiếp trên màng bao gồm tính tan của màng protein Mất nước Sự mất ổn định của lớp đôi lipit Kết tủa muối Không rõ Hình thành bọt khí Tổn thương cơ học Tính nhớt môi trường tăng Quá trình khuếch tán, kể cả sự thẩm thấu bị hạn chế Thay đổi pH Protein bị biến tính Tế bào bị chèn xếp khít lại Sự tổn thương của màng (1) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh chậm, sự tổn thương xảy ra do những tác động dung dịch (ví dụ như nồng độ chất tan/chất điện li, sự mất nước của tế bào nhanh đột ngột, và sự giảm phần không bị đóng đá trong khoảng không ngoại bào). (2) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh nhanh, sự tổn thương do hình thành đá nội bào gây chết. Nhiệt độ làm lạnh tối ưu cho sự sống sót của tế bào phải đủ thấp để tránh sự hình thành đá nội bào, nhưng cũng phải đủ cao để giảm đến mức tối thiểu những tác động của dung dịch. Thuyết 2 yếu tố Hình 7. Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh lên sức sống tế bào Quy trình đông lạnh-giải đông tối ưu Tổn thương “dung dịch” Tổn thương đá nội bào Tốc độ làm lạnh Sức sống 7 Hình 7 mô tả nhiệt độ làm lạnh tối ưu, ở đó hai yếu tố gây thiệt hại được giữ một cách cân bằng, và xác suất sống của tế bào đạt đến một giá trị cực đại. Những giá trị tốt nhất cho tất cả các quá trình làm lạnh hữu dụng có thể được giải thích trong giới hạn của sự cân bằng giữa tác động dung dịch và sự hình thành đá nội bào. Mặc dù, từ những bằng chứng thực nghiệm đều thấy rằng, thuyết hai yếu tố nói trên như là một lời giải thích hiển nhiên, hợp lí về sự tổn thương của tế bào trong suốt quá trình làm lạnh, nhưng phương pháp bảo quản bằng đông lạnh tốt nhất sẽ khác nhau tuỳ vào từng loại tế bào. Bổ sung thêm cho hai cơ chế tổn thương này, còn có những cơ chế khác đáng quan tâm, chẳng hạn sự làm lạnh cũng có thể gây nên tổn thương hệ miễn dịch và kích hoạt tế bào chết theo chương trình (apoptosis), có thể những vấn đề nêu trên cũng là nguyên nhân gây ra sự tổn thương tế bào. Tế bào ít khi tiếp xúc trực tiếp với các tinh thể nước đá, và đúng hơn là chúng tập hợp vào những nơi không có sự đóng băng, đồng thời cũng chính tại các vị trí này, tế bào được cô lập bởi các tác nhân vật lý, và điều này đã tạo nên các stress cho tế bào. Đó là sự phản ứng tự nhiên của tế bào đối với các tác nhân này để chúng có thể sống sót và tồn tại. Tế bào phải chịu tác động của những tác nhân nói trên và luôn luôn thay đổi trong suốt quá trình đông lạnh. Tuy nhiên, các phản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất là yếu tố có tính quyết định đầu tiên cho sự tồn tại của tế bào. Trong những môi trường ưu trương, tế bào sẽ gặp phải sự mất tính thấm với nước, giới hạn tổn thương này phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh. Sức chịu đựng của tế bào khi đông lạnh tại những thang nhiệt độ chậm sẽ phụ thuộc vào khả năng của tế bào, nhằm chống lại sự thâm nhập của các tác nhân stress. Sức chống chịu của tế bào trước áp lực của sự tăng khuếch tán nước, khi nhiệt độ làm lạnh tăng và những thành phần của tế bào có thể chậm đông hơn, trước khi tất cả những phần nước đóng băng bị loại thải. Dưới những điều kiện này, tế bào co lại và sự tổn thương màng sẽ giảm đến mức tối thiểu. Những hiện tượng này xảy ra khi tốc độ làm lạnh được cho là tốt nhất. 2. Chất bảo quản đông lạnh 2.1. Định nghĩa Là những chất tan được trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào. 2.2. Tác dụng Thâm nhập và thay chỗ cho nước bên trong tế bào Giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào Giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đa Hạn chế sự gia tăng nồng độ của các chất hoà tan Kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào 2.3. Đặc tính của chất bảo quản đông lạnh Có thể thấm qua màng tế bào một cách bị động Có khả năng hoạt động thay thế nước Chỉ độc với tế bào ở nồng độ cao 2.4. Phân loại Trong quá trình đông lạnh, tế bào chỉ có khả năng sống được nếu trong môi trường có chất bảo quản đông lạnh thích hợp. Hiệu quả của từng chất bảo quản đông lạnh lên từng loại tế bào rất khác nhau. Các loại chất bảo quản đông lạnh thường được sử dụng trong trữ tế bào: Glycerol DMSO (Dimethyl sulfoxide) 1,2-propanodiol (propylene glycol) 1,2-ethalnediol (ethylene glycol) 8 2.5. Nguyên tắc hoạt động của chất bảo quản đông lạnh Hoạt động của chất bảo quản đông lạnh thể hiện qua 2 hiện tượng “khử nước” trong quá trình đông lạnh và “bù nước “ trong quá trình giải đông. 2.5.1. Sự khử nước Theo nguyên tắc, phôi ở môi trường nuôi cấy có sử dụng chất bảo quản đông lạnh phải trải qua phản ứng thẩm thấu, vì vậy sẽ mất nước. Sau một thời gian (thời gian này nhanh hơn khi ở nhiệt độ cao so với ở nhiệt độ thấp), tế bào hấp thụ chất bảo quản đông lạnh và trở lại thể tích ban đầu. Khi tế bào trở lại thể tích bình thường thì quá trình đông lạnh bắt đầu. Do có sự bổ sung chất bảo quản đông lạnh nên nước trong tế bào có ít hơn và do đó, ít hình thành tinh thể đá hơn. Hình 8. Khối lượng tế bào phôi tương ứng trong quá trình A.Trữ trong nitơ lỏng B. Tan đông C. Tái thủy hợp D. Trong môi trường nuôi cấy 2.5.2. Sự bù nước Sau khi tan đông, trong quá trình bù lại nước, phản ứng của phôi hoàn toàn ngược lại. Quá trình này diễn ra chậm. Nếu có quá ít chất bảo quản đông lạnh trong môi trường bù nước, tế bào sẽ phồng lên và vỡ do áp suất thẩm thấu trong tế bào cao. Vì vậy, quá trình bù nước xảy ra từng bước một, tế bào được nuôi trong môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh giảm dần. Mỗi lần như vậy, thể tích của phôi tăng lên do hấp thu nước, rồi trở lại bình thường do chất bảo quản đông lạnh thoát ra. 2.5.3. Các chất không thấm Chất không thấm là những đại phân tử tuy không xâm nhập tế bào nhưng cũng được xem như những chất bảo quản đông lạnh, được dùng kèm với những chất bảo quản đông lạnh nội bào. Các chất không thấm hoạt động phối hợp với các chất bảo quản đông lạnh, làm giảm áp suất thẩm thấu bên ngoài tế bào, dẫn đến hiện tượng chất bảo quản đông lạnh thoát ra nhiều hơn. Do đó, tế bào được bảo vệ tránh khỏi các tổn thương do tế bào bị phình to trong quá trình bù nước. Các chất không thấm thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide. Sucrose và dextran được sử dụng phổ biến. Hình 9. Sự thay đổi khối lượng tế bào trong quá trình đông lạnh có sử dụng kèm sucrose ở các quá trình 9 A. Trữ trong nitơ lỏng B. Tan đông C. Tái thủy hợp khi có đường sucrose D. Trong môi trường nuôi cấy 2.6. Nồng độ chất bảo quản đông lạnh Tất cả chất bảo quản đông lạnh đều là những chất gây độc cho tế bào. Việc sử dụng chúng phù hợp cho từng loại tế bào, từng giai đoạn của tế bào cũng như sử dụng với một nồng độ thích hợp là rất quan trọng. Các tính chất của chất bảo quản đông lạnh như: khả năng thấm được vào trong tế bào, tính độc đối với tế bào, cũng như những ảnh hưởng sinh học trên tế bào sẽ được xác định trên thực nghiệm để đánh giá, lựa chọn chất bảo quản tốt nhất. Độ đậm đặc của các chất bảo quản đông lạnh tăng lên khi nhiệt độ giảm. Điều này dẫn đến độ nhớt của dung dịch tăng, từ đó, chuyển động của nước và sự xáo trộn của các thành phần trong dung dịch giảm. III. KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1. Nguyên, vật liệu được dùng trong đông lạnh 1.1. Môi trường đông lạnh Môi trường đông lạnh và giải đông được lọc vô trùng với phin 0,22 µm và giữ ở nhiệt độ 4 0 C, được sử dụng ở nhiệt độ phòng trong 48h. Ngoài chất bảo quản đông lạnh, các chất được bổ sung vào môi trường bảo quản bao gồm: 1.1.1. HEPES Vì quá trình đông lạnh và làm tan đông được thực hiện ngoài tủ ấm CO 2 nên môi trường có đệm HEPES thường được sử dụng. Môi trường này có thể là môi trường nuôi cấy. 1.1.2. Huyết thanh Mặc dù vai trò của huyết thanh trong trữ lạnh tế bào chưa được làm rõ. Một số nghiên cứu chứng tỏ rằng khi sử dụng môi trường có bổ sung huyết thanh, sau giải đông, khả năng sống của tế bào tăng; đối với tế bào phôi, ngoài sức sống tế bào tăng, tỉ lệ có thai cũng như tỉ lệ thai làm tổ sau khi chuyển phôi cũng gia tăng. Tuy nhiên, việc dùng huyết thanh trong trữ lạnh làm gia tăng nguy cơ các bệnh truyền nhiễm cũng như phải chấp nhận tính không ổn định của huyết thanh với rất nhiều thành phần không thể xác định được. 1.1.3. Kháng sinh Việc sử dụng kháng sinh nhằm mục đích hạn chế sự nhiễm khuẩn trong quá trình đông lạnh và giải đông. 1.1.4. Muối: đóng vai trò đệm sinh lí 1.1.5. Đường Đường là nguồn cung cấp năng lượng chính và cũng được xem như một tác nhân bảo quản đông lạnh do có tương tác trực tiếp với màng tế bào. Đường sẽ ngăn cản sự khử nước quá mức của màng và làm giảm sự chuyển phase của phospholipid khi hạ nhiệt độ. Sucrose là một trong những loại đường được sử dụng với mục đích này. 1.1.6. Một số chất khác: như Natri pyruvat, polyethylenglycol (PEG 8000), … 1.2. Ni-tơ lỏng Ni-tơ lỏng là ni-tơ dạng khí được cô đặc lại. Chúng không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc. Ni-tơ lỏng rất lạnh, có nhiệt độ là -196 0 C, nhiệt độ sôi khoảng -210 0 C. Do đó, khi thao tác với ni-tơ lỏng phải mang găng tay và mắt kính bảo vệ. 1.3. Thiết bị trữ lạnh bằng ni-tơ lỏng Thiết bị này là những bình chứa ni-tơ lỏng được thiết kế đặc biệt Bình này được gắn nhôm, cô lập hoàn toàn với bên ngoài Cổ bình thường được làm bằng nhựa tổng hợp Bình chịu nhiệt và rất rắn chắc. 10 Bình trữ ni-tơ lỏng có nhiều loại và thường xuyên được cải tiến nhằm phục vụ cho việc bảo quản đông lạnh một cách hiệu quả và tiện lợi hơn. Hình 10. Sự phân bố nhiệt độ trong bình trữ ni-tơ lỏng Các thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng cho phép trữ lạnh ở pha khí ở trên có nhiệt độ từ - 140 o C đến -180 o C và pha lỏng ở dưới có nhiệt độ dưới -196 o C. Việc trữ ở pha khí làm giảm đáng kể nguy cơ rò rỉ hay nổ của các ống/tube chứa mẫu trong lúc lấy ra để giải đông. Tuy nhiên, vì một lượng lớn ni-tơ lỏng bị giảm để cung cấp không gian cho việc trữ ở pha khí nên thời gian giữ lạnh (duy trì nhiệt độ trữ mà không cần bổ sung ni-tơ lỏng) giảm xuống. Điều này làm giảm giới hạn an toàn và đòi hỏi phải kiểm soát và bổ sung thường xuyên. Nhiệt độ trong bình chứa ni-tơ lỏng có sự khác biệt giữa các vùng, phân bố như hình 10. Những bình trữ ni-tơ lỏng có khả năng duy trì nhiệt độ dưới -130 o C phù hợp với việc trữ lạnh trong thời gian dài. Mặc dù hầu hết các thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng và một số thiết bị lạnh cơ học đạt được yêu cầu này, thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng vẫn được các phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào chuộng hơn. Quyết định chọn cuối cùng thường dựa trên việc cung cấp ni-tơ lỏng ổn định, nhu cầu về khả năng trữ, và ngân sách. Điều quan trọng khi sử dụng thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng là việc kiểm tra định kì mức chất lỏng trong bình chứa. Hơi khí ni-tơ phụ thuộc vào cả mức độ sử dụng và thời gian giữ tĩnh (yên lặng) của bình chứa. Sự gia tăng đột ngột tỉ lệ khí có thể gây ra nhiều vấn đề cho bình trữ. Sự hình thành đá hay tuyết bên ngoài cổ bình có thể làm gia tăng tỉ lệ khí ni-tơ và làm tăng nhiệt độ của phần trên của pha khí trong bình. [...]... thu cặn tế bào và loại bỏ môi trường cũ Rửa đĩa tế bào bằng PBS vài lần Rửa tế bào bằng PBS vài lần Tách toàn bộ tế bào khỏi đĩa nuôi bằng dung dịch trypsin Sau đó, bổ sung chất ức chế protease để làm ngừng hoạt động của trypsin Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ trypsin, chất ức chế protease Rửa tế bào bằng PBS vài lần Xác định số lượng tế bào sống Xác định số lượng tế bào sống Huyền phù cặn tế bào vào... nuôi tế bào trong ít nhất 1 tuần trước khi đông lạnh nhằm dễ dàng phát hiện nhiễm và giảm thiểu khả năng phục hồi của các vi khuẩn tiềm ẩn 3.3 Thu nhận tế bào và đông lạnh Quy trình thu nhận tế bào khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau, thông thường được chia thành hai loại: tế bào bám dính và tế bào không bám dính (tế bào huyền phù) Quy trình thu nhận tế bào bám dính Quy trình thu nhận tế bào. .. loại bỏ dung dịch bảo quản lạnh, tế bào được huyền phù vào môi trường nuôi mới Thao tác loại bỏ chất bảo quản đông lạnh được thực hiện nhanh và nhẹ nhàng nhằm tránh làm tổn thương tế bào Việc bổ sung nhanh một lượng lớn môi trường mới có thể gây shock thẩm thấu cho tế bào Các kĩ thuật được thực hiện tùy theo loại chất bảo quản đông lạnh và đặc tính của tế bào Phần lớn dịch tế bào giải đông được nuôi... tâm để thu cặn tế bào Môi trường mới được thêm vào và số lượng tế bào sống, chết được đếm để xác định hiệu quả đông lạnh Đồng thời, tế bào được đem nuôi cấy 4 Các nguy cơ của việc bảo quản đông lạnh Trong toàn bộ quá trình bảo quản đông lạnh, ở từng giai đoạn, nhiều yếu tố có thể gây những thay đổi cho tế bào 4.1 Trong quá trình thu nhận và xử lí tế bào Việc thu nhận một lượng lớn tế bào ở nhiệt độ... cách bảo quản này, các tế bào có thể sống từ 2-3 tháng Phương pháp này có nhiều tiện lợi cho bảo quản nhanh các tế bào khi nuôi trong flask Các flask chứa tế bào đang được đông lạnh ở -800C có thể được lấy ra, giải đông nhanh bằng cách đặt flask vào nước ấm 370C, trong 2-3 phút Sau khi tan đá, sẽ có hai quần thể tế bào hiện diện trong flask: quần thể tế bào còn bám dính vào bề mặt flask; và quần thể tế. .. của phóng xạ Phóng xạ gây đột biến tự nhiên trên tế bào sống với tỉ lệ khoảng 1% Vì vậy, về lí thuyết, các nhà sinh học về đông lạnh đã cho rằng chất lượng tế bào không bị giảm trong khi bảo quản và tế bào có thể được bảo quản trong hàng ngàn năm 4.4 Trong quá trình giải đông Nguy cơ gây chết tế bào tăng khi thao tác giải đông quá chậm hay chất bảo quản đông lạnh được loại bỏ không hợp lí THAM KHẢO... và quần thể tế bào nổi lên Số lượng tế bào nổi lên nhiều hay ít phụ thuộc vào mật độ tế bào trước khi nuôi, và sức khỏe tế bào khi tiến hành đông lạnh Thông thường, công việc được bắt đầu bàng cách đổ bỏ dịch nổi (có chứa quần thể tế bào nổi), và sau đó bổ sung môi trường mới (môi trường nuôi cấy tăng sinh) để tiếp tục nuôi Các tế bào nổi khi đếm với trypan blue thì cho thấy số lượng tế bào chết thấp... ngay vào bình flask và môi trường có chứa chất bảo quản đông lạnh được thay sau khi tế bào đã bám vào bề mặt nuôi cấy và tiếp tục thay mỗi 6 – 8 giờ sau đó cho đến khi chất bảo quản đông lạnh được pha loãng đến mức thấp nhất Đối với tế bào nhạy cảm với chất bảo quản đông lạnh, việc loại bỏ hoàn toàn chất này trước khi tái nuôi cấy là rất cần thiết Dịch tế bào sau khi tan đông được bổ sung thêm môi trường... lạnh Việc lựa chọn chất bảo quản đông lạnh phù hợp với từng loại tế bào và nồng độ thích hợp rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả đông lạnh DMSO và glycerol được sử dụng phổ biến nhất vì có khả năng áp dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau Nồng độ chất bảo quản đông lạnh thường là 5 -10% - Trypsin hay tác nhân tách tế bào - Thuốc nhuộm như trypan blue để xác định tỉ lệ tế bào sống, chết trước và... hay với điều kiện dung dịch quá base trong thời gian dài làm tăng tỉ lệ chết của tế bào Nguy cơ này cũng có thể xảy ra khi xử lí tế bào với chất bảo quản đông lạnh Các chất này độc đối với tế bào nên khi được sử dụng với nồng độ hay thời gian xử lí không phù hợp sẽ gây chết tế bào 4.2 Trong quá trình đông lạnh Tổn thương tế bào tăng và hiệu quả tái nuôi cấy giảm khi đông lạnh với tỉ lệ làm lạnh quá nhanh . thấp hơn tỉ trọng của nước). Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giải đông tế bào. Năm 1 988 , Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác động của sự hình thành đá. Kích thước của. vitro. (6) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái. (7) Giảm chi phí nuôi cấy. (8) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng. (9) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen. (10) Thuận lợi. Enzyme Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37 o C xuống còn 7 o C, hoạt động của enzyme giảm 8 lần. Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng. Từ 20 o C,