Đang tải... (xem toàn văn)
đồ án công nghệ 1, tìm hiểu về bệnh đốm trắng ở tôm ....... đồ án tham khảo cho các bạn học năm 4 làm đồ án công nghệ 1.... chúc các bạn thành công và luôn may mắn.............................. goodlucky.............................................................................................................
Đồ án công nghệ 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO. TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ I Đề tài : Nghiên cứu về bệnh đốm trắng ở tôm WSSV Giáo viên hướng dẫn : PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ Sinh viên thực hiện : TRẦN DUY SƠN NGUYỄN THỊ THÂN NGUYỄN THỊ THANH NHÀN Lớp : 10SH Đà Nẵng,ngày….tháng… năm… SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 PHỤ LỤC: Các hình vẽ trong đồ án ST T Hình vẽ Tên hình vẽ Trang 1 Hình 2.1 Phân bố địa lí bệnh đốm trắng 3 2 Hình 4.1 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dưới kính hiển vi điện tử 7 3 Hình 4.2 Cấu trúc protein của virus WSSV 8 4 Hình 4.3 Nucleocasid của WSSV đã nhuộm âm được quan sát dưới kính hiển vi điện tử 8 5 Hình 4.4 Cấu trúc nucleocapsid của WSSV 9 6 Hình 4.5 Bản đồ điện di protein của WSSV và mô hình cấu tạo Whispovirus 10 7 Hình 4.6 Vị trí của 39 gen mã hóa cho 39 protein cấu trúc trong genome của WSSV 13 8 Hình 4.7 DNA của WSSV bị cắt bởi bởi enzyme giới hạn 14 9 Hình 5.1 Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng 16 10 Hình 5.2 Vỏ đầu ngực của tôm bị bệnh đốm trắng do vi khuẩn 17 11 Hình 6.1 Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng trong ao nuôi 18 12 Hình 6.2 Sơ đồ thể hiện nguyên nhân và cơ chế gây bệnh đốm trắng (WSSV) 19 13 Hinh 7.1 Thiết bị PCR 21 14 Hình 7.2 Nguyên lí của phản ứng PCR 22 15 Hình 7.3 Các chu kì của kĩ thuật PCR. 22 16 Hình 7.4 Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase 24 17 Hình 7.5 Quy trình của phản ứng PCR 25 18 Hình 7.6 Hệ thống Real-time PCR 26 19 Hình 7.7 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real-time PCR 28 20 Hình 7.8 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại cường độ huỳnh quang 29 21 Hình 7.9 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ:nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ 31 22 Hình7.10 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 32 23 Hình7.11 Đồ thị biễu diển mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kì của 12 mẩu tôm sú 33 24 Hình7.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 3 mẫu tôm sú 34 25 Hình7.13 Quy trình thực hiện Real - time PCR 36 26 Hình7.14 Mô hình chung cho kỹ thuật chạy PCR 37 PHỤ LỤC: Các bảng,biểu đồ trong đồ án: SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 ST T Bảng/biể u Tên bảng/biểu đồ Trang 1 Bảng 3.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng 7 2 Bảng 4.1 Trọng lượng phân tử của 5 loại protein chính ở WSSV 11 PHỤ LỤC: Danh sách các chữ viết tắt trong đồ án. 1. WSSV : White Spot Syndrome Virus 2. PCR : Polymerase Chain Reaction 3. PL : Postlarve 4. MBV : Monodon Baculovirus 5. VP28 : Envelope protein (28kDa) 6. VP26 : Envelope protein (26kDa) 7. KDa : Kilo Dalton 8. DNA : Deoxyribonucleic acid 9. UV : Ultraviolet 10. NTP : Deoxynucleoside-triphosphate 11. WSBV: White Spot Baculovirus Virus 12.WSVD : White Spot Viral Disease 13.WSS : White Spot Syndrome 14. WSV : White Spot Virus 15.SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease 16.HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus 17.WSBV : White Spot Baculovirus Virus 18.WSVD : White Spot Viral Disease 19.WSS : White Spot Syndrome SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 20.WSV : White Spot Virus SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 I. ĐẶT VẤN ĐỀ - Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh đặc biệt nguy hiểm xảy ra trên rất nhiều đối tượng tôm nuôi và các loại giáp xác khác.Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Bệnh hội chứng đốm trắng đã và đang gây nhiều thiệt hại cho ngành nuôi trồng thủy sản đặc biệt là ngành nuôi tôm trên thế giới,vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Vì vậy, việc nghiên cứu để hiểu rõ bản chất tác nhân gây bệnh là hết sức cần thiết. SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 6 Đồ án công nghệ 1 TỔNG QUAN 2.1. Lịch sử xuất hiện của hiện tượng đốm trắng ở tôm: Bệnh đốm trắng xuất hiện lần đầu tiên ở vùng đông bắc của Đài Loan vào cuối năm 1991 đầu 1992.Đầu tiên virus này chỉ gây bệnh trên loài tôm Marsupenaeus japonicus. Sau đó bệnh lan truyền sang loài tôm sú Penaeus monodon. Bệnh hội chứng đốm trắng trên tôm nhanh chóng lan rộng ra các tỉnh ven biển từ bắc tới nam của Trung Quốc. Các loài tôm M. japonicus, P. monodon và Fenneropenaeus chinensis đều có thể bị bệnh này, sau đó dịch bệnh lan sang Nhật Bản (1993), Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) kèm theo sự sa sút nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên [29]. Từ đầu năm 1999, hội chứng đốm trắng xuất hiện và lan nhanh từ Trung Mỹ đến Bắc Mỹ và sau đó bệnh đã lan khắp Châu Âu và Châu Úc. Hình 2.1: Phân bố địa lí bệnh đốm trắng SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 7 Đồ án công nghệ 1 2.2. Tình hình bệnh và tác hại của đốm trắng đối với nghề tôm trên thế giới: Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay.Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm và ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới [3]. Trong thời gian qua, bệnh đốm trắng đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á. Bệnh đốm trắng đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và Ấn Độ. Trong thời gian 1994 – 1995, virus gây bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi (P. monodon; P. indicus) dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ [11]. Ở Thái Lan, dịch bệnh đốm trắng bùng nổ đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225 000 tấn năm 1995 xuống 160 000 tấn năm 1996, làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm [3]. Thực tế hiện nay ở các nước trong khu vực Đông Nam Á, bệnh đốm trắng được xem là phổ biến và nguy hiểm nhất. Vì vậy, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lây nhiễm và bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi [3] 2.3.Tình hình bệnh và tác hại của đốm trắng đối với nghề tôm ở Viêt Nam: Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển. Sản lượng tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần 10% sản lượng tôm Châu Á, mang lại lợi ích đáng kể cho người nuôi tôm[4]. Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô công nghiệp, “dịch bệnh” tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ những năm đầu thập niên 90. Năm2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phìa Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34.3%) có tôm nuôi và tôm cua tự nhiên đã mang mầm bệnh đốm trắng và có 169 hộ SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 8 Đồ án công nghệ 1 (34.99%) có tôm chết vì bệnh đốm trắng. Năm 2003, Bùi Quang Tề và cộng sự phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và tôm chân trắng nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh) và tôm Postlarve (PL) đưa từ Quảng Nam và Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm (PL) đưa từ Đà Nẵng, Quảng Nam là 23,08%; tôm sú nuôi thương phẩm ở các tỉnh phìa Bắc là 26,92%; tôm chân trắng là 13,33% [11] . Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tìch có tôm bị chết trong cả nước. Bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm 2003 do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ 25 - 46,6%, trung bình 38,9%. Theo số liệu từ Trung Tâm Môi Trường và Dịch Bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I), Thanh Hóa có hơn 40% diện tìch nuôi tôm bị bệnh, trong đó phần lớn thường là bệnh đốm trắng.Bệnh này tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70 / 110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Những ngày đầu năm 2004, tại nhiều tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đã xảy ra tính trạng tôm nuôi bị chết do virus gây bệnh đốm trắng gây nên và bệnh này lây lan nhanh ngay từ đầu vụ. Hiện nay, bệnh đốm trắng vẫn đang diễn ra và đã gây nhiều tổn thất cho nhiều hộ dân tại các tỉnh này [10]. SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 9 Đồ án công nghệ 1 Nhín chung, tình hình dịch bệnh đốm trắng diễn ra ở Việt Nam rất nghiêm trọng và đã ảnh hưởng lớn đến nghề nuôi tôm trong cả nước. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH 3.1. Tên gọi WSSV: Tên WSSV có nguồn gốc từ các dấu hiệu lâm sàn của bệnh,ví dụ như sự xuất hiện của những đốm trắng và canxi lắng đọng bên trong lớp biểu bì tôm 3.2. Định danh và phân loại: Định danh - Giống: Non Occuluded Baculovirus - Họ: Baculoviridae - Họ phụ: NudiBaculoviridae Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (2002), các nhà khoa học đã phân loại virus gây bệnh đốm trắng là một giống mới Whisspovirus thuộc họ mới Nimaviridae [11]. Tác nhân virus gây bệnh đốm trắng được gọi bởi nhiều tên do nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau [28]: - WSSV: White Spot Syndrome Virus - WSBV: White Spot Baculovirus Virus - WSVD: White Spot Viral Disease - WSS: White Spot Syndrome - WSV: White Spot Virus - SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease - HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm: Bảng 3.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng [11] Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 10 [...]... tra ở mức độ mô học và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR Hình 5.2:Vỏ đầu ngực của tôm bị bệnh đốm trắng do vi khuẩn ( Nguồn: Nongnghiep.net.vn ) 5.3 Đốm trắng do môi trường: Tôm có đốm trắng ở vỏ đầu ngực hoặc phần vỏ ở sống lưng nhưng vẫn khoẻ mạnh, không có tôm tấp bờ, đàn tôm vẫn hoạt động và ăn đều ở mức bình thường, chu kỳ lột xác dài hơn bình thường và tôm sinh trưởng hơi chậm thì nguyên nhân bị đốm trắng. .. sắc Đốm trắng hình tròn, nhỏ và ít hơn đốm trắng do vi-rus (WSSV) Soi mẫu tươi dưới kính hiển vi đốm trắng có dạng lan tỏa hình địa y với viền kiểu gờ khía tròn ở giữa rỗng, trong khi đó đốm trắng do vi-rus có đốm đen (melanin) ở giữa Các đốm trắng thường chỉ ở phía ngoài lớp biểu bì và tổ chức liên kết Nhìn chung tôm có ăn chậm hơn nhưng không gây thiệt hại đáng kể SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 20 Đồ án. .. 1-2 tháng sau khi thả nuôi, khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất hiện.Khi các đốm trắng xuất hiện sau 3-10 ngày tôm chết hầu hết trong ao nuôi (100%), tỉ lệ chết cao và nhanh SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 19 Đồ án công nghệ 1 Hình 5 .1: Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng [20] 5.2 Đốm trắng do vi khuẩn: Tác nhân gây bệnh Vi khuẩn gây hội chứng đốm trắng (Bacterial White Spot Syndrome - BWSS)... truyền chủ yếu Bệnh đốm trắng dễ bị bùng phát khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004) Hình 6.1:Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng trong ao nuôi (theo Passano L.M 1960) [5] SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 22 Đồ án công nghệ 1 6.2 Cơ chế gây bệnh: Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô... [5] Ngoài ra, tôm ăn phải virus tự do tồn tại trong bùn ao và trong nước cũng dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV [1] SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 23 Đồ án công nghệ 1 Hình 6.2: Sơ đồ thể hiện nguyên nhân và cơ chế gây bệnh đốm trắng (WSSV) CHUẨN ĐOÁN BỆNH Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau [7] - Phương pháp mô học: dấu hiệu định bệnh là sự xuất... VP26, VP24, VP15 Dấu hiệu bệnh lý Triệu chứng của bệnh là tôm có rất nhiều đốm trắng kích thước 0,5-2,0 mm xuất hiện bên trong vỏ nhất là ở giáp đầu ngực (Hình 5.1), đốt bụng thứ 5, thứ 6 và lan toàn thân Bên cạnh đó, tôm bệnh hoạt động kém, ăn nhiều đột ngột sau đó bỏ ăn, bơi lờ đờ ở mặt nước hay dạt vào bờ ao Đôi khi tôm có dấu hiệu đỏ thân .Bệnh thường xuất hiện ở thời điểm 1-2 tháng sau khi thả nuôi,... chủ yếu là kháng thể chống SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 14 Đồ án công nghệ 1 lại VP28, vì kháng thể này có thể làm mất khả năng xâm nhập của WSSV [26] Theo Jeroen Witteveldt và cộng sự khi so sánh giữa 2 kháng thể chống lại VP28 và VP19 thì ông cho rằng kháng thể chống lại VP28 giúp tôm chống lại bệnh rất hiệu quả còn kháng thể chống lại VP19 thì hầu như không có khả năng giúp tôm chống lại bệnh [21] Ngoài... hoạt động theo nguyên tắc sau: Nguồn chiếu sáng qua kính lọc kích thích và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt Ánh sáng kích thích này giúp chất chỉ thị huỳnh quang tương ứng với số DNA đích trong ống phản ứng ánh sáng Ánh sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng.Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh sáng có bước song thích hợp.Sau đó,ánh sáng sẽ qua bộ phận khuếch đại tín hiệu,cuối... đến một số loài thuộc họ Bacillaceae Dấu hiệu bệnh lý Trong giai đoạn đầu nhiễm khuẩn tôm vẫn còn hoạt động ăn mồi và lột vỏ, lúc đó có thể mất đi các đốm trắng Tuy nhiên quá trình lột vỏ bị chậm lại, chậm lớn và chết rải rác đối với tôm bị nhiễm nặng nhưng không có hiện tượng tôm chết hàng loạt, hầu hết tôm bị đóng rong, mang bị bẩn .Tôm bệnh có các đốm trắng mờ đục nhìn thấy trên vỏ khắp cơ thể (Hình.. .Đồ án công nghệ 1 Virus Trung Quốc (HHNBV) Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) Virus bệnh đốm trắng Thái lan (SEMBV) Virus bệnh (WSBV) đốm 54 x 216 nm 89 x 201 nm 70-150x350- trắng 120 x 360 nm 84 x 226 nm 83 x 275 nm 121 x 276 nm 58-67x330- 380nm 350nm ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN CỦA VIRUT GÂY BỆNH:WSSV 4.1 Đặc điểm hình thái: - Virus dạng hình . NHÀN Lớp : 10SH Đà Nẵng,ngày….tháng… năm… SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 PHỤ LỤC: Các hình vẽ trong đồ án ST T Hình vẽ Tên hình vẽ Trang 1. chung cho kỹ thuật chạy PCR 37 PHỤ LỤC: Các bảng,biểu đồ trong đồ án: SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Đồ án công nghệ 1 ST T Bảng/biể u Tên bảng/biểu đồ Trang 1 Bảng 3.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng. dựa vào protein vỏ để tạo ra kháng thể chống lại sự xâm nhập của WSSV, chủ yếu là kháng thể chống SVTH:Trần Duy Sơn-10SH Page 14 Đồ án công nghệ 1 lại VP28, vì kháng thể này có thể làm mất khả