ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình dạy dỗ trong những năm qua, và cám ơn bộ môn đã tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành tốt luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương, cô đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cám ơn chị KS. Nguyễn Thị Mỹ Hòa, người đã giúp đỡ tôi trong việc tìm kiếm và sử dụng nguyên liệu. Chị đã giúp đỡ tôi rất nhiều về vật chất lẫn tinh thần trong quá trình thực hiện luận văn. Cám ơn, các cán bộ giáo viên phòng thí nghiệm 102, 108, 117, của bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi có thể sử dụng những thiết bị và dụng cụ thí nghiệm, hoàn thành tốt luận văn. Cám ơn các bạn lớp HC06BSH, những người bạn đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Cuối cùng, tôi đặc biệt cảm ơn ba mẹ đã sinh thành, dạy dỗ cho tôi có được ngày hôm nay. Ba mẹ đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều về tinh thần lẫn vật chất. Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người! iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Probiotic là: “các vi sinh vật sống mà khi sử dụng với số lượng đủ sẽ mang lại những lợi ích về sức khỏe cho vật chủ”. Vi khuẩn lactic bổ sung vào sản phẩm probiotic là chủng Bifidobacterium. Sản phẩm probiotic, có khả năng cải thiện hệ tiêu hóa và tăng cường hệ miễn dịch cho người sử dụng. Với mục tiêu đa dạng hóa các sản phẩm probiotic, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển sản phẩm nước táo pha sữa giàu probiotic tại công ty Kirin Acecook Viet Nam”. Nội dung đề tài: 1. Khảo sát giống vi khuẩn B. bifium trên môi trường MRS và môi trường sữa. Xác định thời điểm thu sinh khối tối ưu. 2. Khảo sát thành phần môi trường lên men tạo sản phẩm. Xác định hàm lượng sữa gầy, nước táo, đường fructose, saccharose bổ sung. 3. Khảo sát điều kiện lên men như nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ giống. 4. Tiến hành khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm, và đánh giá cảm quan về chất lượng của sản phẩm. Kết quả đề tài: 1. Khảo sát giống vi khuẩn B. bifidum trên môi trường MRS lỏng thời gian tối ưu thu sinh khối là 24h - 30h. Trên môi trường sữa gầy có bổ sung đường glucose là 48h. 2. Kết quả thành phần môi trường lên men là: sữa gầy 3,38% (w/v), nước táo 1,5% (w/v), đường fructose 7% (w/v), đường saccharose 9% (w/v). Môi trường có pH = 6,0 độ Brix = 18. 3. Kết quả khảo sát điều kiện lên men: nhiệt độ tối ưu là 37 o C, thời gian lên men 48h, tỷ lệ giống cấy vào là 2,5% (v/v) với mật độ 2,57.10 8 tế bào/ml. 4. Bảo quản sản phẩm probiotic ở nhiệt độ 10 – 12 o C, trong 4 tuần mật độ tế bào còn sống trên 10 7 tế bào/ml. Kết quả đánh giá cảm quan thị hiếu được người tiêu dùng chấp nhận ở mức độ cao. iv MỤC LỤC MỤC LỤC IV DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH IX DANH MỤC SƠ ĐỒ IX DANH MỤC ĐỒ THỊ X LỜI MỞ ĐẦU XI CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. PROBIOTIC 1 1.1.1. Khái niệm 1 1.1.2. Lịch sử phát triển 1 1.1.3. Tác dụng của sản phẩm 2 1.1.4.Một số giống vi khuẩn probiotic 5 1.2. Đặc điểm giống Bifidobacterium bifidum ………………………… ……… 6 1.2.1. Phân loại 6 1.2.2. Phân lập 6 1.2.3. Đặc điểm hình thái, tế bào 7 1.2.4. Đặc điểm sinh lý 8 1.2.5. Đặc điểm sinh hóa 9 1.2.6. Nhu cầu dinh dưỡng 9 1.2.7. Bản chất quá trình lên men 9 1.3. Đặc điểm của nguyên liệu…………………………………………………… 13 1.3.1. Thành phần và tính chất nước táo 13 1.3.2. Thành phần và tính chất sữa 15 v 1.3.3. Phản ứng tạo màu Maillard 17 1.4. Công nghệ sản xuất sản phẩm probiotic…………………………………… 19 1.4.1. Nguyên liệu 21 1.4.2. Thuyết minh qui trình 21 1.5. Tình hình sản xuất sản phẩm sữa probiotic trong và ngoài nước…………… 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 30 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu…………………………………………30 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 30 2.1.2. Nguyên liệu 30 2.1.3. Môi trường 30 2.1.4. Hóa chất 31 2.1.5. Dụng cụ 31 2.1.6. Thiết bị 31 2.2. Sơ đồ nội dung thí nghiệm.……………………………………………………32 2.3. Nội dung bố trí thí nghiệm…………………………………………………….33 2.3.1. Khảo sát giống 33 2.3.2. Khảo sát điều kiện lên men 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 40 3.1. Kết quả khảo sát hình thái tế bào…………………………………………… 40 3.2. Kết quả khảo sát quá trình sinh trưởng của vi khuẩn B. bifidum…………….41 3.3. Kết quả khảo sát điều kiện lên men………………………………………… 48 3.4. Kết quả khảo sát chất lượng sản phẩm……………………………………… 64 3.4.1. Kết quả khảo sát thời gian bảo quản 65 3.4.2. Kết quả đánh giá cảm quan 66 vi 3.4.3. Đánh giá giá thành sản phẩm 67 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1. Kết luận…………………………………………………….………………….69 4.2. Kiến nghị………………………………………………………………………69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 76 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tác dụng probiotic………………………………………………………… 4 Bảng 1.2: Một số giống probitoic………………………………………………… 5 Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng trong 100g nước ép táo………………………… 13 Bảng 1.4: Giá trị năng lượng có trong 100g nước táo……………………………… 14 Bảng 1.5: Hàm lượng vitamin có trong 100g nước ép táo……………………… 14 Bảng 1.6: Hàm lượng khoáng có trong 100g nước ép táo……………………………14 Bảng 1.7: Một số chỉ tiêu vật lý của sữa bò………………………………………… 15 Bảng 1.8: Thành phần sữa bò…………………………………………………………16 Bảng 1.9 : Một vài sản phẩm prbiotic được ưa chuộng trên thế giới hiện nay……….26 Bảng 2.1: Khảo sát điều kiện lên men……………………………………………… 37 Bảng 3.1 : Số liệu đường cong sinh trưởng trên môi trường MRS……………… 42 Bảng 3.2: Số liệu đường cong sinh trưởng trên môi trường sữa gầy (MSG1) ………44 Bảng 3.3: Số liệu kết quả khảo sát hàm lượng sữa gầy (MSG2)…………………… 49 Bảng 3.4: Số liệu kết quả khảo sát hàm lượng đường fructose……………………….51 Bảng 3.5: Số liệu kết quả khảo sát hàm lượng đường saccharose……………………52 Bảng 3.6: Số liệu kết quả khảo sát hàm lượng nước táo……………………….… 54 Bảng 3.7: Số liệu kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ………………………….56 Bảng 3.8: Số liệu kết quả khảo sát theo tỷ lệ giống………………………………… 58 Bảng 3.9: Bảng kết quả khảo sát tỉ lệ giống khô bổ sung…………………………….60 Bảng 3.10: Số liệu kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men………………… 62 Bảng 3.11: Bảng công thức pha chế ban đầu sản phẩm nước ép táo pha sữa giàu probiotic ………………………………………………………………………………64 Bảng 3.12: Số liệu kết quả mật độ probiotic theo thời gian bảo quản…………… ….65 viii Bảng 3.13: Điểm đánh giá chất lượng cảm quan…………………………………… 66 Bảng 3.14: Kết quả đánh giá cảm quan……………………………………………….66 Bảng 3.14: Bảng giá thành nguyên liệu sử dụng…………………….……………… 68 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào B. bifidum……………………………………………………………………7 Hình 1.2. Cấu trúc furfural và hydroxymethylfurfural……………………………… 19 Hình 1.3. Vi khuẩn Lactobacillus casei shirota và sản phẩm Yakult ……………….25 Hình 2.1. Dịch lên men sau khi thanh trùng 90 0 C trong 5 phút …………………… 35 Hình 2.2. Sản phẩm sau 48h lên men…………………………………………………36 Hình 2.3. Sản phẩm sau khi đồng hóa và phối chế……………………………………36 Hình 3.1. Hình tế bào B. bifidum quan sát dưới kình hiển vi……………………… 40 Hình 3.2. Hình khuẩn lạc của vi khuẩn B. bifidum………………………………… 41 Hình 3.3. Sản phẩm với tỷ lệ nước táo 3% và tỳ lệ nước táo 2,0% 55 Hình 3.4. Sản phẩm thức uống táo pha sữa giàu probiotic……………………………64 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacteria bifidum……………………… 7 Sơ đồ 1.2. Sơ đồ đồng hóa O 2 đối với Bifidobacterium……………………………… 8 Sơ đồ 1.3. Sơ đồ chuyển hóa đường hexoes của B. bifidum tạo ra lactate, acetate, formate, ethanol……………………………………………………………………….10 Sơ đồ 1.4. Con đường chuyển hóa đường hexoes của Bifidobacterium tạo ra lactate………………………………………………………………………………….11 Sơ đồ 1.5. Phản ứng giữa glucose và acid amin………………………………………18 Sơ đồ 1.6. Sự sắp xếp amadori và phản ứng của HMF……………………………….18 Sơ đồ 1.7. Công nghệ sản xuất sữa……………………………………………………20 x DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Đường cong sinh trưởng của B. bifidum trên môi trường MRS…… 42 Đồ thị 3.2.a. Đường cong sinh trưởng của B. bifidum trên MSG1……………………46 Đồ thị 3.2.b. Đường cong sinh trưởng của B. bifidum trên MSG2………………… 46 Đồ thị 3.3. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH trong môi trường MSG1 theo thời gian 47 Đồ thị 3.4. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid trong môi trường MSG1 theo thời gian, thể hiện qua thể tích NaOH 0,1N/1ml mẫu……………………………… 48 Đồ thị 3.5. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, lượng acid lactic (g/l) sinh ra đối với tỷ lệ sữa khác nhau……………………………………………………………… 50 Đồ thị 3.6. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, lượng acid lactic sinh ra (g/l) đối với tỷ lệ đường fructose khác nhau………………………………………………… 51 Đồ thị 3.7. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, lượng acid lactic sinh ra (g/l) đối với tỷ lệ đường saccharose khác nhau……………………………………………… 53 Đồ thị 3.8. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, lượng acid lactic sinh ra (g/l) đối với tỷ lệ nước táo khác nhau………………………………………………………… 55 Đồ thị 3.9. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, lượng acid lactic sinh ra trong những điều kiện nhiệt độ khác nhau………………………………………………… 57 Đồ thị 3.10. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, thể tích NaOH 0,1N đối với tỷ lệ giống khác nhau……………………………………………………………………….59 Đồ thị 3.11. Đồ thị mật độ tế bào theo tỉ lệ giống khô bổ sung ………………………60 Đồ thị 3.12. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lg CFU, pH, thể tích NaOH 0,1N theo thời gian, trong môi trường lên men……………………………………………………….63 Đồ thị 3.13. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn B. bifidum trong môi trường lên men……………………………………………………………………………………63 Đồ thị 4.1. Đường chuẩn OD…………………………………………………………77 xi LỜI MỞ ĐẦU Xã hội hiện đại, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp thực phẩm, việc ăn uống của con người cũng theo chế độ công nghiệp. Thực phẩm công nghiệp thường nhiều dầu mỡ, chất bảo quản, phụ gia, phẩm màu, và không đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng cho người sử dụng. Hậu quả là ngày càng có nhiều bệnh có liên quan đến chế độ ăn uống như béo phì, cao huyết áp, sự suy giảm miễn dịch, bệnh về đường tiêu hóa, …Vì thế, con người ngày nay có xu hướng tìm đến những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, hay những loại thực phẩm chức năng, nhằm bổ sung nhiều chất dinh dưỡng có lợi vào cơ thể, đồng thời để cải thiện và bảo vệ sức khỏe. Trên cơ sở, tạo ra một dòng sản phẩm giúp bảo vệ và cải thiện sức khỏe cho con người, sản phẩm probiotic ra đời đáp ứng nhu cầu đó. Sản phẩm probiotic chứa nhiều vi sinh vật sống có lợi cho hệ tiêu hóa, giúp tăng cường hệ miễn dịch, giảm các nguy cơ mắc bệnh đường tiêu hóa, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Với những lợi ích đó, sản phẩm probiotic đã và đang được người tiêu dùng đón nhận, như một sản phẩm có lợi cho sức khỏe. Sản phẩm probiotic có nhiều dạng, như thuốc viên, thuốc nang, thực phẩm chức năng, thức uống từ sữa, thức uống trái cây, bột ngũ cốc, kem, … Sản phẩm probiotic đầu tiên có nguyên liệu từ sữa, do nhà khoa học người Nga phát hiện ra, vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus, có mặt trong sản phẩm yogurt, sữa chua. Vi sinh vật thường sử dụng trong các sản phẩm probiotic là chủng vi khuẩn lactic, ngoài ra còn có nấm men. Những sản phẩm probiotic từ sữa rất đa dạng như yogurt, sữa chua uống, sữa lên men, phô mai, sữa kefir. Hiện nay, những sản phẩm probiotic từ nguyên liệu sữa đã rất phổ biến và được yêu thích rộng rãi, đặc biệt là trẻ em. Không dừng lại ở đây các nhà sản xuất đa dạng hóa sản phẩm probiotic bằng nhiều nguyên liệu khác nhau như các loại nước ép trái cây, sữa đậu nành, … Sản phẩm probiotic hiện đã có mặt tại Việt Nam với nhiều loại mặt hàng như: yogurt, phô mai, sữa kefir, sữa chua của Vinamilk, sữa chua Long Thành, sữa chua [...]... bổ sung probiotic của Vinamilk, sữa Yakult của công ty Yakult Việt Nam Cùng với xu hướng phát triển mạnh mẽ của sản phẩm probiotic, nhiệm vụ của luận văn được giao Nghiên cứu phát triển sản phẩm nước táo pha sữa giàu probiotic tại công ty Kirin Acecook Viet Nam , với mục đích đa dạng hóa các dòng sản phẩm probiotic trên thị trường, trên nền tảng của dòng sản phẩm nước táo pha sữa của công ty Nhiệm... cầu sản phẩm trong suốt thời gian bảo quản không bị đóng cặn, không làm giảm pH, mật độ tế bào không được thấp hơn 107 tế bào/ml 1.5 Tình hình sản xuất sản phẩm sữa probiotic trong và ngoài nƣớc: 1.5.1 Tình hình sản xuất trong nƣớc: Sản phẩm probiotic là một dòng sản phẩm mới đối vơi nước ta Sản phẩm probiotic đầu tiên du nhập vào Việt Nam là Yalult – thức uống sữa probiotic, Yakult là một sản phẩm. .. chung, có nhiều ý kiến trái chiều về sản phẩm probiotic, nhưng không ý kiến nào phủ nhận về lợi ích của vi khuẩn probiotic [34, 35] Công ty sữa Việt Nam Vinamilk, với các sản phẩm như sữa tươi, sữa đặc, sữa bột, sữa chua, sữa kefir, nay đã cho ra mắt thức uống “Probi” bổ sung đến 13 tỉ men sống Lactobacillus casei, trong 65ml sản phẩm Hiện nay, có nhiều nghiên cứu trong nước liên quan đến probotic như... 1.4 Công nghệ sản xuất sản phẩm probiotic: Sản phẩm probiotic là dạng thực phẩm có lợi cho sức khỏe, đã có từ rất lâu như các sản phẩm: yaourt, sữa chua, pho mát, sữa kefir … Đây là dòng sản phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe, đã được cơ quan chức năng công nhận 19 Chƣơng 1 Tổng Quan Tài Liệu Qui trình sản xuất sản phẩm probiotic, gần giống với quá trình sản xuất sữa lên men, hay yaourt... trùng Đối với sản phẩm nước táo pha sữa, thì cần bổ sung thêm đường saccharose (nếu cần) và hương táo vào sản phẩm Đảm bảo độ Brix của sản phẩm từ 18 - 20 1.4.2.8 Quá trình rót sản phẩm và bảo quản sản phẩm: Quá trình rót sản phẩm trong điều kiện vô trùng, bao bì nhựa, ép nắp chân không Tránh không cho không khí lọt vào, khoảng không giữa dịch lỏng và nắp bao bì càng nhỏ càng tốt Sản phẩm sau cùng... cho sản phẩm dạng uống (vì sản phẩm bị dông tụ), và không có quá trình xử lý nhiệt sau lên men [3] Trong công nghiệp probiotic trong sữa được sản xuất theo qui trình sau đây Sữa nguyên liệu Đường Phối trộn Nước táo Bài khí Đồng hóa Giống B bifidum Thanh trùng Hoạt hóa Phối trộn Nhân giống Lên men Đồng hóa Hương, màu, Rót sản phẩm chất ổn định Bảo quản lạnh Probiotic Sơ đồ 1.7 Công nghệ sản xuất sữa probiotic. .. việc tạo màu cho sản phẩm, nhờ phản ứng Maillard Ngoài ra, bổ sung chất ổn định để tăng hiệu suất đồng hóa và tính đồng nhất của sữa Chất ổn định hay sử dụng là pectin, soyafiber, Đối với gelatin, B bifidum không có khả năng sử dụng Tùy thuộc vào nhu cầu của sản xuất, đa dạng hóa sản phẩm mà có thể bổ sung thêm nước trái cây, hương liệu, màu, … Đối với sản phẩm nước táo pha sữa, nước táo bổ sung ngay... phẩm probiotic có rất nhiều loại như thức uống lên men giàu probiotic, thực phẩm từ sữa, ngủ cốc có bổ sung probiotic, nước ép trái cây bổ sung probiotic Để đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng, nhà sản xuất phải luôn sáng tạo nhằm tìm những sản phẩm mới và phát triển sản phẩm hiện có, vừa phải đáp ứng nhu cầu cảm quan, thị hiếu, và chất lượng probiotic Nhìn chung, 25 ... dạng và kích thước hạt sản phẩm, áp suất đồng hóa có thể đến 500 bar [3] Việc tiến hành đồng hóa sau lên men với mục đích tạo sự đồng nhất cho sản phẩm, vì sản phẩm probiotic có pH thấp hơn 4,6 (điểm đẳng điện của casein) nên sữa bị đông tụ Vì thế việc đồng hóa vô trùng sau lên men là rất quan trọng Sản phẩm sữa probiotic là dạng uống nên cần đạt độ đồng nhất cao Đây là sản phẩm chứa vi sinh vật sống... Nguyễn Thúy Hương (2007) đã nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa chua đậu nành bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic [4] 1.5.2 Tình hình sản xuất trên thế giới: Khái niệm probiotic đã được đưa ra khá lâu, và ngày nay người tiêu dùng với trình độ hiểu biết tăng cao, họ đã nhận thức được lợi ích của sản phẩm probiotic, và ngày càng quan tâm nhiều hơn đến dòng sản phẩm này Sản phẩm probiotic có rất nhiều loại . xu hướng phát triển mạnh mẽ của sản phẩm probiotic, nhiệm vụ của luận văn được giao Nghiên cứu phát triển sản phẩm nước táo pha sữa giàu probiotic tại công ty Kirin Acecook Viet Nam , với. cứu phát triển sản phẩm nước táo pha sữa giàu probiotic tại công ty Kirin Acecook Viet Nam . Nội dung đề tài: 1. Khảo sát giống vi khuẩn B. bifium trên môi trường MRS và môi trường sữa. Xác. khuẩn B. bifidum………………………………… 41 Hình 3.3. Sản phẩm với tỷ lệ nước táo 3% và tỳ lệ nước táo 2,0% 55 Hình 3.4. Sản phẩm thức uống táo pha sữa giàu probiotic …………………………64 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ