ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng suy giảm tế bào gốc biểu mô giác mạc là một trong những di chứng thường gặp của tổn thương bề mặt nhãn cầu (BMNC). Ở Việt Nam, một trong những nguyên nhân phổ biến gây tổn thương BMNC là bỏng mắt do hoá chất hoặc nhiệt. Biểu hiện của hội chứng này là mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác mạc. Hội chứng suy giảm tế bào gốc của giác mạc cũng có thể gây nên hiện tượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát. Vì vậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau. Để điều trị, các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạc vùng rìa. Mục đích của các phẫu thuật nhằm làm tăng số lượng tế bào gốc biểu mô giác mạc hoặc cải thiện môi trường vùng rìa củng giác mạc và hỗ trợ quá trình tái tạo lớp biểu mô giác mạc. Tuy nhiên, phương pháp ghép kết mạc rìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắt lành phải khá lớn. Mặt khác, phương pháp này cũng không thể thực hiện được ở các trường hợp bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt [3,4,5, 25]. Đối với các trường hợp bệnh nhân bị tổn thương BMNC cả hai mắt, trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép vùng rìa dị thân, ghép kết mạc - rìa dị thân hoặc ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy dị thân. Tuy nhiên, những bệnh nhân này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao. Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng là những biểu mô lát tầng không sừng hoá. Những tế bào lớp đáy của cả hai loại biểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý. Về nguồn gốc phôi thai, hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc là ngoại bì da. Năm 2003, Nakamura và cộng sự đã nuôi cấy thành công tế bào biểu mô niêm mạc miệng và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc. Việc sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọn 1 tốt cho các bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa. Với phương pháp này, người bệnh không phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép như khi ghép vùng rìa hoặc ghép kết mạc-rìa dị thân. Với mong muốn đưa một phương pháp điều trị tổn thương BMNC mới vào Việt Nam, trong phạm vi đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng”, chúng tôi tiến hành một phần nghiên cứu với mục tiêu sau đây: Xác định ưu nhược điểm của hai phương pháp tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng thỏ: bằng dịch treo và bằng mảnh mô niêm mạc miệng. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu(BMNC) 1.1.1. Sơ lược giải phẫu lớp vỏ ngoài của nhãn cầu Lớp vỏ ngoài của nhãn cầu hay còn gọi là lớp áo xơ là một màng liên kết xơ khá dày và dai, gồm có hai phần: giác mạc trong suốt chiếm 1/6 phía trước, củng mạc màu trắng đục chiếm 5/6 phía sau. Vùng giáp ranh giữa củng mạc và giác mạc gọi là vùng rìa. Vùng rìa củng-giác mạc có vai trò rất quan trọng trong việc tái tạo biểu mô bề mặt nhãn cầu. 1.1.2. Định nghĩa bề mặt nhãn cầu Về mặt giải phẫu, bề mặt nhãn cầu là toàn bộ biểu mô được giới hạn bởi hai đường xám của mi trên và mi dưới. Về mặt mô học, biểu mô bề mặt nhãn cầu gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và biểu mô vùng rìa. 1.1.3. Biểu mô giác mạc Biểu mô giác mạc là biểu mô lát tầng không sừng hoá, dày khoảng 50µm, chiếm khoảng 10% chiều dày giác mạc. Biểu mô giác mạc gồm 5-6 hàng tế bào, chia thành ba lớp: lớp bề mặt, lớp trung gian và lớp đáy. Biểu mô này có khả năng tái tạo rất cao. Các tế bào biểu mô ở lớp bề mặt liên tục bong ra và mất đi trong màng nước mắt và sẽ được thay thế bởi những tế bào mới nhờ sự phân chia của các tế bào gốc cư trú ở vùng rìa củng-giác mạc. Biểu mô giác mạc được chứng minh là có sự đổi mới toàn bộ hằng định sau khoảng 7- 10 ngày. Lớp tế bào bề mặt thường gồm hai hàng tế bào đa diện dẹt. Các tế bào này liên kết với nhau rất chặt chẽ nhờ các cấu trúc liên kết: vòng dính, dải bịt, thể liên kết. Chính sự liên kết chặt chẽ này đã tạo ra một hàng rào vững chắc ở biểu mô giác mạc ngăn không cho nước và các chất ở bên ngoài thấm qua. 3 Ở mặt tự do của tế bào có rất nhiều vi nhung mao, các vi nhung mao này có lớp áo glycocalyx. Các vi nhung mao làm tăng diện tích bề mặt tế bào biểu mô tạo điều kiện thuận lợi cho việc trao đổi chất dinh dưỡng và oxy qua màng tế bào. Hơn nữa, các vi nhung mao cùng với lớp glycocalyx đã góp phần tạo ra sự ổn định cho lớp phim nước mắt, chống khô giác mạc và hạn chế xâm nhập của các tác nhân bệnh lý. Lớp tế bào trung gian gồm 2-3 hàng tế bào đa diện. Đây là lớp chuyển tiếp giữa lớp tế bào đáy và lớp tế bào bề mặt. Tế bào lớp đáy có hình trụ, xếp thành một hàng bám chặt vào màng đáy,dán vào màng Bowman chính thức. Tế bào đáy có khả năng gián phân để tạo ra các tế bào lớp trên của giác mạc. 1.1.4. Biểu mô kết mạc Kết mạc là một bộ phận phụ thuộc nhãn cầu, trải từ vùng rìa củng giác mạc đến đường xám của bờ mi, được chia thành 3 phần. Kết mạc mi lợp mặt trong của mi mắt, thuộc loại biểu mô trụ tầng không sừng hoá. Kết mạc nhãn cầu lợp mặt trước nhãn cầu (trừ diện giác mạc), thuộc loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Kết mạc cùng đồ tiếp nối kết mạc nhãn cầu với kết mạc mi. Biểu mô của kết mạc nhãn cầu gồm 6-8 hàng tế bào, các tế bào biểu mô kết mạc không đều đặn và có kích thước nhỏ hơn so với các tế bào biểu mô giác mạc. Đặc biệt, xen kẽ với các tế bào nằm trên cùng của kết mạc có một số tế bào hình đài, chiếm khoảng 5-10% số lượng tế bào biểu mô bề mặt nhãn cầu. Trong bào tương của chúng có nhiều không bào chứa các hạt nhày. Chức năng của chúng là tiết dịch nhày tạo thành phần của lớp phim nước mắt. Bản chất của chất nhày là glycoprotein do đó khi nhuộm P.A.S và quan sát trên kính hiển vi quang học thấy các tế bào hình đài bắt màu khác so với các tế bào xung quanh. Các tế bào hình đài chỉ có trong kết mạc, không có ở giác mạc. Vì vậy về mặt mô học, sự có mặt của các tế bào hình đài ở vùng trung tâm giác mạc là bằng chứng thuyết phục của hiện tượng xâm lấn kết mạc vào giác mạc - hậu quả của suy giảm tế bào gốc vùng rìa củng-giác mạc. Lớp đệm của kết mạc là mô liên kết thưa với nhiều mạch máu, mạch bạch 4 huyết và nhiều loại tế bào: lympho bào, dưỡng bào, tương bào và bạch cầu đa nhân. Những tế bào này có thể đi vào lớp biểu mô. 1.1.5. Biểu mô vùng rìa củng-giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc  Vùng rìa là vùng tiếp nối giữa củng mạc với giác mạc, ở đây có sự chuyển tiếp từ biểu mô giác mạc thành biểu mô kết mạc nhãn cầu. Về mặt mô học, mốc xác định của vùng rìa là: tại đây không có màng Bowman và màng Descemet. Việc phân định ranh giới giữa vùng rìa và kết mạc là tương đối khó. Nhưng có thể xác định được vị trí tương ứng, đó là nơi gặp nhau giữa mống mắt và mô nền giác mạc; hơn nữa, khác với kết mạc, biểu mô vùng rìa không có tế bào hình đài tiết nhày [1]. Về mặt cấu tạo, vùng rìa củng-giác mạc là một vùng hình nhẫn nằm giữa củng mạc và giác mạc. Vòng nhẫn này rộng hơn ở phía trên (1,5mm) và phía dưới (1mm), còn ở hai bên thì hẹp, khoảng 0,8mm [4]. Biểu mô vùng rìa củng giác mạc gồm 7-10 hàng tế bào, các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau giống như các tế bào của biểu mô giác mạc. Bên dưới màng đáy, mô liên kết của vùng rìa tập trung nhiều dây thần kinh và giàu mạch máu, ngoài ra còn thấy sự có mặt của một số tế bào trung mô.  Tế bào gốc biểu mô giác mạc Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các tế bào gốc của biểu mô giác mạc tập trung ở lớp đáy của biểu mô vùng rìa. Để chứng minh được giả thuyết này, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều bằng chứng thuyết phục: - Trước hết, Keratin 3 (K3) được biết là dấu ấn của các tế bào biểu mô giác mạc biệt hoá ở mức cao. K3 biểu lộ ở tất cả các tế bào biểu mô vùng trung tâm giác mạc, nhưng ở biểu mô vùng rìa K3 chỉ biểu lộ ở các tế bào trên lớp đáy. - Một bằng chứng nữa cho quan niệm tế bào gốc biểu mô giác mạc cư trú ở vùng rìa là từ những nghiên cứu về nuôi cấy tế bào. Thực nghiệm cho thấy các tế bào đáy vùng rìa thể hiện đặc điểm tăng sinh của các tế bào gốc. 5 Trong nuôi cấy, các tế bào này có khả năng tăng sinh mạnh mẽ hơn nhiều so với các tế bào biểu mô ở trung tâm giác mạc. Có những nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc vùng rìa để lý giải cho sự tồn tại của những tế bào gốc ở đây. Với chức năng tái tạo các cơ quan, tế bào gốc cơ thể trưởng thành có mặt rải rác khắp cơ thể. Nhưng chúng chỉ cư trú trong những nơi có điểu kiện bảo vệ tốt. Năm 1978, Shofield đã nêu một giả thuyết về “ổ tế bào gốc” để giải thích trạng thái không biệt hoá của tế bào gốc. Theo đó, “ổ tế bào gốc” được xem như một ổ vi môi trường đặc biệt có tính tổ chức cao, trong đó có chứa nhiều yếu tố khác nhau được cho rằng có vai trò trong việc duy trì trạng thái không biệt hoá của tế bào gốc như: các cytokine, sự tương tác giữa các tế bào gốc với mô đệm, sự kết dính giữa các tế bào [28]. Thật vậy, vùng rìa giác mạc tập hợp tất cả những điều kiện tối ưu để bảo vệ các tế bào gốc khỏi các kích thích làm chúng biệt hoá. Tại đây, bên cạnh các tế bào gốc còn có nhiều hắc tố bào, có các tế bào trình diện kháng nguyên Langerhans và những lympho bào T hỗ trợ. Chúng được cho rằng có vai trò bảo vệ các tế bào gốc. Hắc tố bào có những nhánh bào tương xoè rộng ra xung quanh bao lấy tế bào biểu mô lớp đáy, chúng tổng hợp và vận chuyển sắc tố melanin vào tế bào biểu mô do đó làm giảm đến mức tối thiểu những tổn thương gây ra bởi bức xạ cực tím. Ngoài ra, không như ở giác mạc, màng đáy biểu mô vùng rìa có cửa sổ và lồi lõm do mô đệm có nhú. Cấu trúc hình thái này ở vùng rìa cho thấy các tế bào gốc có sự liên hệ mật thiết với các tế bào ở mô đệm phía dưới. Cấu tạo đặc biệt của màng đáy vùng rìa được xem như là yếu tố quyết định sự phân bố các tế bào gốc trong ổ của nó. 1.1.6. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc  Nguyên nhân Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa có thể nguyên phát, liên quan tới những bệnh lý làm thay đổi vi môi trường của tế bào gốc, ví dụ như: tật không mống mắt, viêm giác mạc liên quan tới suy nhiều tuyến nội tiết, chứng đỏ da dày sừng bẩm sinh; hoặc có thể là hậu quả thứ phát của sự phá huỷ tế bào gốc do các yếu tố bên ngoài như: bỏng hoá chất, bỏng 6 nhiệt, hội chứng Stevens Jonhson, đeo kính áp tròng hoặc do nhiễm khuẩn lan rộng [11, 29, 30, 31].  Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa Suy giảm vùng rìa có thể xảy ra lan tràn toàn bộ hoặc chỉ ở một góc của vùng rìa. Trong trường hợp suy giảm một phần vùng rìa, sự xâm lấn của biểu mô kết mạc chỉ ảnh hưởng tới một phần bề mặt giác mạc. Triệu chứng chủ quan của người bệnh: Nhìn mờ, cộm chói, chảy nước mắt, co quắp mi mắt và có thể có những đợt đau đỏ mắt tái phát. Trong suy giảm tế bào gốc một phần sự xâm nhập tổ chức xơ mạch ở vùng rìa biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau, trong khi biểu mô giác mạc ở trung tâm vẫn còn bình thường. Trong suy giảm tế bào gốc toàn bộ, mức độ tổn thương phụ thuộc vào nguyên nhân do thứ phát hay nguyên phát. Biểu hiện lâm sàng c ó thể chỉ là giác mạc mờ đục, bề mặt gồ ghề không đều, có tân mạch nông hoặc sâu trong bề dày giác mạc hoặc kết mạc hóa giác mạc. Nặng hơn nữa có thể là ổ loét giác mạc khó hàn gắn, bờ ổ loét ranh giới rõ và gồ lên, xung quanh ổ loét có thể tồn tại tổ chức xơ tân mạch, BMNC gồ ghề với biểu hiện của một quá trình viêm mãn tính, nhuyễn giác mạc, giác mạc mỏng hoặc thủng giác mạc có thể xảy ra trong trường hợp nặng.  Phương pháp điều trị Có nhiều phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc. Việc nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc để ghép điều trị cho các bệnh nhân bị hội chứng suy giảm vùng rìa do các nguyên nhân khác nhau là một phương pháp hiện đại và hiệu quả. Tuy nhiên, xung quanh phương pháp này còn nhiều vấn đề cần nghiên cứu và trong một số trường hợp như thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa toàn bộ cả hai bên mắt thì ghép đồng loại hoặc sử dụng nguồn tế bào biểu mô tự thân thay thế là giải pháp phải lựa chọn, mô vùng rìa đồng loại có thể lấy từ giác mạc của tử thi hoặc của người hiến tình nguyện. Rất nhiều các nghiên cứu về khả năng và thành công của ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đã được thông báo. Sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy là một lựa chọn hợp lý 7 và tỏ ra có nhiều tiến bộ hơn các phương pháp ghép dị thân vì khi ghép dị thân bệnh nhân phải sử dụng thuốc ức chế miễn dịch để chống thải loại mảnh ghép, vừa gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn vừa gây ra sự tốn kém về kinh tế cho bệnh nhân, vả lại nếu có sử dụng lâu dài thì cũng không thể chắc chắn được sự tồn tại của mảnh ghép trên cơ thể người bệnh. Một ưu điểm nữa của phương pháp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng đó là niêm mạc miệng được cho là ở giai đoạn biệt hoá thấp hơn so với tế bào sừng ở da, nó có khả năng phân chia rất nhanh duy trì trong khoảng thời gian dài ở điều kiện nuôi cấy mà không hoá sừng. Hơn thế nữa, K3 thể hiện ở cả biểu mô giác mạc và biểu mô niêm mạc miệng chứ không có ở biểu mô da, chứng tỏ sự gần gũi hơn của biểu mô niêm mạc miệng và giác mạc. Sử dụng tấm biểu mô kết mạc để cấy ghép cũng có thể dùng để điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu có thể thay thế kết mạc hoặc giác mạc tổn thương. Nicol Scuderi và cộng sự năm 2002 đã nuôi cấy thành công tấm biểu mô kết mạc và ghép tự thân tấm này trên mắt của 4 bệnh nhân tổn thương kết mạc, kết quả cho thấy bệnh nhân đã nhanh chóng cải thiện được về mặt thẩm mỹ, biểu mô tồn tại tốt [24]. Mặc dù khi cấy ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng hay biểu mô kết mạc đều có thể xảy ra hình thành tân mạch ngoại vi giác mạc nên có thể mất khả năng nhìn của người bệnh, song nghiên cứu cho thấy ở tấm biểu mô niêm mạc miệng, do sự thể hiện FGF2 của tế bào gây ra và để tránh biến chứng hình thành tân mạch việc sử dụng kháng FGF2 có thể khắc phục được, mặt khác thủ thuật lấy tấm biểu mô niêm mạc miệng đơn giản hơn nhiều so với lấy tấm biểu mô kết mạc. Như vậy, trong trường hợp không thể sử dụng tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy, việc lựa chọn phương pháp ghép biểu mô niêm mạc miệng là lựa chọn khả quan giúp cải thiện tầm nhìn cho bệnh nhân, bảo vệ phần còn lại của nhãn cầu và giảm các triệu chứng khó chịu gây ra cho người bệnh. 1.2. Cấu trúc biểu mô lợp bề mặt khoang miệng Niêm mạc lợp mặt trong thành miệng gồm mặt trong hai má, mặt dưới vòm miệng và 2 mặt lưỡi. Niêm mạc miệng gồm hai phần chính: biểu mô bề mặt được hỗ trợ bởi lớp mô liên kết xơ chun và lớp dưới biểu mô. 8 Ở nhiều vùng của miệng, niêm mạc miệng gắn chặt vào cấu trúc mô phía dưới bởi thành phần mô liên kết lỏng lẻo là tầng dưới niêm mạc, trừ ở vùng vòm miệng lớp đệm của niêm mạc miệng dính chặt vào màng xương. Ba lớp này có cấu trúc tương tự như cấu trúc của biểu mô, chân bì và hạ bì của da [18]. Biểu mô niêm mạc miệng là loại biểu mô tầng, nó có thể sừng hoá hoặc không sừng hoá tuỳ thuộc vào từng vùng của niêm mạc miệng. Biểu mô lợp niêm mạc môi và niêm mạc má là biểu mô lát tầng không sừng hóa giống với biểu mô trước giác mạc, các tế bào lớp bề mặt không có hạt keratohyaline, ở lớp đáy có các tế bào gốc. Ngoài ra, biểu mô khoang miệng còn có các loại tế bào khác không thuộc dòng sừng hoá: tế bào sắc tố, tế bào Langerhans, tế bào Merkel. Các tế bào biểu mô liên kết với nhau bởi thể liên kết. Ở lớp đáy, các tế bào liên kết với thành phần lớp đệm nhờ thể bán liên kết và màng đáy, màng này chứa nhiều collagen type IV, laminin và fibronectin. Các xơ trung gian trong tế bào được tìm thấy ở tất cả các loại biểu mô và là các dấu ấn cơ bản nhất của sự biệt hoá tế bào. Thông tin về xơ keratin trong tế bào phản ánh cả kiểu loại và tình trạng biệt hoá của tế bào, vị trí phân lớp của biểu mô. Xơ keratin có đường kính từ 6-11nm, là lớp phụ của xơ trung gian đó là những protein dạng sợi dài. Trong tế bào biểu mô xơ này luôn có cấu trúc cặp, gồm 1 keratin type I (acide) có trọng lượng phân tử khoảng 50-60 kD và 1 keratin type II (trung tính hoặc base) có trọng lượng phân tử khoảng 50-70kD, những cặp xơ keratin này kết hợp chặt chẽ xoắn nhau để tạo thành chuỗi xuắn. Nó hình thành một mạng lưới khắp bào tương, các xơ này gắn kết với thể liên kết và thể bán liên kết, nó neo các tế bào biểu mô với nhau và với các màng đáy [1]. Như vậy, về mặt cấu trúc mô học niêm mạc má là loại biểu mô giống với biểu mô giác mạc, nó còn có chung nguồn gốc, có thể nuôi cấy thành công và thay thế được biểu mô giác mạc. 1.3. Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng và ứng dụng 9 1.3.1. Lựa chọn nền nuôi cấy Để nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng, việc đầu tiên là chuẩn bị nền nuôi cấy cho phù hợp và đảm bảo hỗ trợ được cho các tế bào. Có rất nhiều loại nền nuôi cấy khác nhau, có thể là nền tự nhiên như màng ối, nền tổng hợp hoặc phối hợp hai loại trên [18]. Về thành phần và cấu trúc thì màng ối có rất nhiều ưu điểm vượt trội so với các màng sinh học khác bởi tính chun giãn, trong suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng và khó rách. Việc sử dụng màng ối sử dụng làm chất nền nuôi cấy niêm mạc miệng và dùng trong tái thiết bề mặt nhãn cầu đã được Nakamura và cộng sự nghiên cứu năm 2003. Khi nuôi cấy tấm biểu mô niêm mạc miệng trên nền màng ối người, kết quả là tấm biểu mô có rất nhiều thể liên kết và dính chặt vào màng đáy bằng thể bán liên kết, tế bào thể hiện keratin 3, 4 và 13 [19]. Theo nghiên cứu của tác giả Fukuda K. và cộng sự (1999), màng đáy của màng ối hoàn toàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen typ IV, V, fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng để thay thế kết mạc. Các thành phần này đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hoá và sự tăng sinh của các tế bào biểu mô [7]. Mặt khác, hiệu quả chống viêm và bảo vệ bề mặt nhãn cầu của màng ối được giải thích qua sự có mặt nhiều loại cytokin chống viêm. Màng ối có chức năng của một biểu mô phủ, là biểu mô chế tiết và có khả năng trao đổi chất qua đường tế bào và gian tế bào. Màng ối còn có khả năng kháng khuẩn nên nguy cơ nhiễm trùng hậu phẫu ít hơn so với ghép các màng sinh học khác. Việc bóc tách màng ối ra khỏi màng đệm rất dễ dàng, cùng với tính chun giãn tốt của màng ối tạo điều kiện cho các thao tác dàn trải trong quá trình phẫu thuật được dễ dàng. Màng ối là một nguyên liệu sẵn có, dễ lấy, dễ xử lý. Màng ối được bảo quản ở nhiệt độ - 80 O C có thể để được nhiều tháng [6, 12, 20]. Như vậy, màng ối là một màng sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội, được sử dụng để che phủ trên bề mặt nhãn cầu đạt hiệu quả cao. Trong đề tài cấp bộ “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc” chúng tôi đã nghiên cứu và đưa ra được quy trình xử lý màng ối làm nền nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc. 10 [...]... Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng Sau khi nghiên cứu quy trình trích thủ và xử lý mảnh niêm mạc miệng ổn định, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy nhiều đợt bằng cả hai phương pháp: nuôi mảnh mô và nuôi dịch treo Kết quả nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng được thể hiện trong Bảng 1 Bảng 1 Tỉ lệ nuôi cấy thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng Phương pháp nuôi bằng mảnh mô Phương... đã khô, miếng mô được mạ phủ vàng, sau đó kiểm tra trên kính tại viện 69 Bộ tư lệnh Lăng Chủ Tịch Hồ Chí Minh 2.5 Chỉ tiêu nghiên cứu − Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô − Chất lượng của tấm biểu mô nuôi cấy − Thời gian nuôi cấy − Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy − Cấu trúc siêu vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 2.6 Tiêu chuẩn tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy − Mặt tấm biểu mô phẳng, đều... 14 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bằng mảnh mô 21ngày (H.E x400) 1 Tế bào biểu mô 2.Màng ối 3.1.5 Định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy Ngày thứ 4 sau nuôi cấy, bắt đầu quan sát thấy các tế bào biểu mô từ mảnh mô vùng rìa phát triển lan ra xung quanh mảnh mô Sau 10-14 ngày các tế bào đã phủ kín đáy của giếng nuôi cấy Tiếp tục tạo tầng cho tấm biểu mô trong 4-5 ngày sẽ thu được một tấm biểu mô niêm. .. Địa điểm nghiên cứu Bộ môn Mô –Phôi Trường Đại học Y Hà Nội 2.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 10/2010 đến tháng 8/2012 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Mô hình nghiên cứu Nuôi cấy bằng dịch treo Lấy mô vùng niêm mạc miệng thỏ Xử lý mẫu Thu hoạch, định danh tấm biểu mô định kết quả Nhận Nuôi cấy bằng mảnh mô Hình1 Mô hình nghiên cứu 16 2.4.2 Chuẩn bị lồng nuôi cấy  Dụng cụ, vật liệu: − Lồng nuôi cấy... lồng nuôi cấy, mặt biểu mô hướng lên phía trên • Bơm môi trường nuôi cấy vào lồng nuôi và giếng nuôi Giếng nuôi cấy được đặt trong tủ ấm 37 0 C, 5%CO2 Thay môi trường đều đặn 2 ngày/lần Thời gian nuôi cấy thường kéo dài 14 đến 16 ngày Giếng nuôi cấy Lồng nuôi cấy Màng ối TB biểu mô niêm mạc miệng phát triển ra ngoài mảnh mô Mảnh niêm mạc miệng Hình 2 Mô hình nuôi cấy bằng mảnh mô * Nuôi bằng dịch treo... phân chia 28 Hình 12 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bằng mảnh mô 7 ngày (Giemsa x1000) - 14-16 ngày sau nuôi cấy: bề mặt tấm biểu mô phẳng, các tế bào có hình đa diện, ranh giới rõ Biểu mô có độ dày đều đặn và gồm 4-5 hàng tế bào Các tế bào lớp trên cùng dẹt, còn nhân Lớp đáy của biểu mô gắn chặt vào màng ối (Hình 13,14) Hình 13 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bằng mảnh mô 14 ngày (Giemsa x400)...Công trình đã được nghiệm thu và đánh giá tốt Nghiên cứu này giúp chúng tôi có một nền thích hợp để nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy Có hai phương pháp chính để nuôi tạo được tấm biểu mô niêm mạc miệng đó là nuôi cấy bằng mảnh mô và nuôi cấy bằng dịch treo tế bào  Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô Trong phương pháp này, màng ối được sử dụng rộng rãi với... isopropranolol * Nuôi cấy mảnh mô hoặc dịch treo của biểu mô niêm mạc miệng trong tủ 370C, 5% CO2 Thay môi trường 2 ngày/lần Theo dõi sự phát triển của các tế bào biểu mô giác mạc bằng kính hiển vi soi nổi Khi các tế bào đã phủ kín 19 đáy của lồng nuôi cấy, sử dụng kỹ thuật tạo tầng (air-lifting) để tăng số hàng cho tấm biểu mô nuôi cấy trong thời gian 2-4 ngày Quy trình tạo tầng cho tấm biểu mô nuôi cấy như... bào tròn bám vào màng đáy, ở những ngày sau, các tế bào này xoè rộng với các nhánh bào tương khá dài Hình 8 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bằng dịch treo 7 ngày (Giemsa x500) - 12-14 ngày sau nuôi cấy: tế bào biểu mô phủ kín lồng nuôi cấy và được tạo tầng trong 3-4 ngày 26 Hình 9 Tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy bằng dịch treo 14 ngày (Giemsa x250) - Sau khi tạo tầng, các tấm biểu mô có bề mặt... của nuôi cấy, khi thấy các tế bào biểu mô mọc kín giếng nuôi cấy, tiến hành tạo tầng cho tấm biểu mô + Bơm môi trường vào giếng nuôi cấy và lồng nuôi cấy + Hút hết môi trường trong lồng nuôi cấy bỏ đi, để cho các tế bào biểu mô tiếp xúc với không khí + Đặt giếng nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 5%CO2 + Thay môi trường trong giếng nuôi cấy hàng ngày * Lấy tấm biểu mô nuôi cấy để định danh 2.4.6 Thu hoạch và . [18]. Biểu mô niêm mạc miệng là loại biểu mô tầng, nó có thể sừng hoá hoặc không sừng hoá tuỳ thuộc vào từng vùng của niêm mạc miệng. Biểu mô lợp niêm mạc môi và niêm mạc má là biểu mô lát tầng. điều kiện nuôi cấy mà không hoá sừng. Hơn thế nữa, K3 thể hiện ở cả biểu mô giác mạc và biểu mô niêm mạc miệng chứ không có ở biểu mô da, chứng tỏ sự gần gũi hơn của biểu mô niêm mạc miệng và giác mạc. . mô học niêm mạc má là loại biểu mô giống với biểu mô giác mạc, nó còn có chung nguồn gốc, có thể nuôi cấy thành công và thay thế được biểu mô giác mạc. 1.3. Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu