1 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đề tài này Trước hết tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu - Trường Đại học Nha Trang, Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác Quốc tế, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến, Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện về kinh phí và cơ sở vật chất cho tôi thực hiện đề tài này. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó giám đốc - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và Cử nhân Ngô Anh Tiến đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cám ơn: TS. Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS.TS. Trần Thị Luyến, PGS.TS. Lương Đức Phẩm - Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: cô Ths. Khúc Thị An, các quý thầy cô giáo phòng Thí nghiệm Hóa sinh – Vi sinh, phòng Thí nghiệm Công nghệ Chế biến - Khoa Chế biến và Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nha Trang, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Sinh viên Bùi Thị Phượng 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN (S.CARLSBERGENSIS) 2 1.1.1. Cấu tạo và hình thái nấm men 2 1.1.2. Đặc tính sinh lý tế bào nấm men 6 1.2. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY THU SINH KHỐI VI SINH VẬT 12 1.2.1. Khái niệm về protein đơn bào 14 1.2.2. Giới thiệu về ứng dụng của sinh khối vi sinh vật 14 1.3. GIỚI THIỆU MỘT SỐ NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN DÙNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TĂNG SINH S.CARLSBERGENSIS 16 1.3.1. Đậu tương 16 1.3.2. Cám gạo 18 1.3.3. Khoai tây 19 1.3.4. Bột ngô 19 1.3.5. Giá đậu xanh 20 1.3.6. Bắp cải 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 22 2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật 22 2.3.2. Các phương pháp nuôi cấy nấm men 23 3 2.3.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 23 2.3.2.2. Phương pháp hoạt hóa S.carlsbergensis từ đông khô 25 2.3.2.3. Thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa S.carlsbergensis bằng môi trường Hansen 28 2.3.2.4. Thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối bằng MTTN 29 2.3.2.5. Phương pháp giữ giống và cấy chuyền 33 2.3.2.6. Phương pháp nhân giống, lên men và thu sinh khối 35 2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 36 2.5. CÁC DỤNG CỤ THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 36 2.5.1. Các dụng cụ thiết bị chủ yếu 36 2.5.2. Các loại hóa chất 36 2.6. Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO HOẠT HÓA S.CARLSBERGENSIS BẰNG MÔI TRƯỜNG HANSEN 37 3.1.1. Xác định thời gian hoạt hóa cho S.carlsbergensis 37 3.1.2. Xác định pH thích hợp cho hoạt động của S.carlsbergensis 38 3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của S.carlsbergensis 39 3.2. XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH NUÔI TĂNG SINH KHỐI BẰNG MTTN 40 3.2.1. Xác định môi trường nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 40 3.2.2. Xác định tỷ lệ cơ chất pha MT6 cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 41 3.2.3. Xác định tỷ lệ đường Saccharose bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 42 3.2.4. Xác định tỷ lệ dịch tự thủy phân nấm men bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 43 3.2.5. Xác định tỷ lệ một số khoáng bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 44 3.2.5.1. Xác định hàm lượng MgSO 4 bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 44 3.2.5.2. Xác định hàm lượng K 2 HPO 4 bổ sung thích hợp cho nuôi tăng sinh S.carlsbergensis 45 3.2.6. Xác định thời gian nuôi tăng sinh khối S.carlsbergensis 46 4 3.2.7. Xác định pH nuôi tăng sinh khối S.carlsbergensis 47 3.3. THỬ NGHIỆM LÀM KHÔ SINH KHỐI NẤM MEN 48 3.4. ĐỀ XUẤT NUÔI THU SINH KHỐI S.CARLSBERGENSIS 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 5 DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG TRANG 1 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của nấm men 7 2 Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid trong đậu tương tách dầu 16 3 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong chất béo đậu tương 17 4 Bảng 1.4. Hàm lượng chất vô cơ trong đậu tương 17 5 Bảng 1.5. Hàm lượng vitamin trong đậu tương 18 6 Bảng 1.6. Bảng hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cải bắp 21 7 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu chất lượng của men sau sấy 48 8 Bảng 3.2. Bảng hàm lượng protein hòa tan của S.carlsbergensis 53 9 Bảng 3.3. Bảng biểu hiện lượng sinh khối thu hồi của S.carlsbergensis 53 6 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG 1 Hình 1.1. Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men 2 2 Hình 1.2. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men 3 3 Hình 1.3. Phương thức sinh sản của tế bào nấm men 6 4 Hình 2.1. Sơ đồ chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men 24 5 Hình 3.1. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo thời gian nuôi cấy 37 6 Hình 3.2. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo pH nuôi cấy 38 7 Hình 3.3. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo nhiệt độ nuôi cấy 39 8 Hình 3.4. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo môi trường nuôi cấy 40 9 Hình 3.5. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ cơ chất pha môi trường nuôi cấy 41 10 Hình 3.6. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ đường saccharose 42 11 Hình 3.7. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo tỷ lệ cao nấm men bổ sung 43 12 Hình 3.8. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo hàm lượng MgSO 4 bổ sung 44 13 Hình 3.9. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo hàm lượng K 2 HPO 4 bổ sung 45 14 Hình 3.10. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo thời gian nuôi cấy 47 15 Hình 3.11. Sự biến đổi mật độ quang dịch nuôi theo pH của môi trường nuôi 48 16 Hình 3.12. Hình ảnh Saccharomyces carlsbergensis nhuộm tiêu bản sống nuôi trên môi trường Hansen 52 17 Hình 3.13. Hình ảnh Saccharomyces carlsbergensis nhuộm tiêu bản sống nuôi trên môi trường nghiên cứu 52 7 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT MT: môi trường MTTN: môi trường tự nhiên MT1: môi trường nước chiết bột ngô MT2: môi trường nước chiết cám gạo MT3: môi trường nước chiết bắp cải MT4: môi trường nước chiết khoai tây MT5: môi trường nước chiết bột đậu tương MT6: môi trường nước chiết giá đậu xanh v/p: vòng/phút 1 MỞ ĐẦU Nấm men là một trong số những vi sinh vật dùng trong sản xuất sinh khối protein (SCP – Single cell protein) do tế bào rất giàu protein và có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, dễ tách thu sinh khối sau khi nuôi sinh khối. Việc nuôi sinh khối vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng hiện nay thường dùng bằng môi trường nuôi nhân tạo hoặc một số nguyên liệu thông thường như rỉ đường, bã rượu…Để góp tìm hiểu khả năng sử dụng môi trường tự nhiên trong việc nuôi sản xuất sinh khối nấm men để sản xuất sinh khối nấm men dùng trong chăn nuôi chúng tôi tiến hành: “Thử nghiệm nuôi sản xuất sinh khối Saccharomyces carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên”. Nội dung của đề tài 1) Nghiên cứu tìm các điều kiện thích hợp cho quá trình hoạt hóa chủng S.carlsbergensis. 2) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi để thu nhận sinh khối nấm men S.carlsbergensis bằng môi trường tự nhiên. 3) Thu nhận sinh khối nấm men và đánh giá sơ bộ sinh khối thu nhận. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm phong phú thêm về môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu hồi sinh khối nói riêng và cho việc ứng dụng nuôi sinh khối nấm men (S.carlsbergensis) nói riêng. Từ đó thu nhận sinh khối nấm men để sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay nuôi trồng thủy sản hay sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình thủy phân sản xuất bột đạm, hoặc bổ sung vào các nguồn chế biến thực phẩm. Do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu, vận dụng kiến thức đã học vào thực hành, năng lực và thời gian có hạn nên em không thể tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài được hoàn thiện hơn. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM MEN (S.CARLSBERGENSIS) Thuật ngữ Nấm men (yeast, levure) chỉ là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nẩy chồi (budding). Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota). 1.1.1. Cấu tạo và hình thái nấm men Nấm men loài Saccharomyces carlsbergensis thuộc giới Eumycophyta (nấm), lớp Ascomycetes, bộ Endomycetes, họ Saccharomycetaceae, giống Saccharomyces, loài carlsbergensis. − Hình dạng tế bào nấm men [8] Hình dạng tế bào của nấm men S.carlsbergensis chủ yếu là hình cầu. Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. Hình 1.1. Hình ảnh tế bào của Saccharomyces carlsbergensis − Kích thước tế bào nấm men. Tế bào nấm men S.carlsbergensis thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 ÷ 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình 3 + Chiều dài: 9 ÷ 10 µ m + Chiều rộng: 2 ÷ 7 µ m Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. − Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Tế bào nấm men S.carlsbergensis cũng như nhiều loại tế bào nấm men khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: N= nhân; M= ty thể; Va= không bào; ER= mạng lưới nội chất; Ves= bào nang Hình 1.2. Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men [17] Vỏ tế bào Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vỏ tế bào nấm men có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào. Thành phần hóa học của vỏ tế bào gồm có các phức chất protein – polysacarit, phosphate và lipit. Vỏ tế bào dày khoảng 25nm và chiếm khoảng 25% khối lượng tế bào. Màng tế bào chất Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày không quá 0,1nm dính chặt với tế bào chất. Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ [...]... môi trư ng t nhiên) D ch sau nuôi c y em xác m t nh quang b Thí nghi m 5: xác nh t l cơ ch t làm môi trư ng nuôi Sau khi ch n ư c môi trư ng thích h p thì t l cơ ch t làm môi trư ng nh hư ng r t l n n kh năng sinh trư ng c a vi sinh v t T l cơ ch t làm môi trư ng ít hay nhi u u nh hư ng n kh năng tăng sinh Do ó ti n hành nghiên c u t l cơ ch t làm môi trư ng nuôi S .carlsbergensis Sau khi ch n ư c môi. .. T NHIÊN DÙNG LÀM MÔI TRƯ NG NUÔI C Y TĂNG SINH S .CARLSBERGENSIS Các nguyên li u t nhiên dùng men S .carlsbergensis là: b t pha môi trư ng d ch th u tương ư c xay t nuôi c y n m u tương, b t cám g o xay ra t thóc, khoai tây, b p c i, b t ngô xay t h t ngô vàng, giá u xanh Ch n các nguyên li u này làm môi trư ng nuôi c y S .carlsbergensis vì chúng r t giàu dinh dư ng cung c p cho S .carlsbergensis tăng sinh. .. t nhiên nghiên c u a Thí nghi m 4: xác nh môi trư ng nuôi c y thích h p Trong lên men công nghi p vi c l a ch n môi trư ng thích h p duy trì kh năng tăng sinh mong mu n là r t c n thi t S .carlsbergensis ư c nuôi c y l c 220 vòng/phút, th i gian nuôi, pH môi trư ng nuôi, nhi t nuôi nghiên c u các thí nghi m 1, 2, 3 trong 6 môi trư ng d ch th ký hi u là: MT1, MT2, MT3, MT3, MT4, MT5, MT6 (thành ph n môi. .. S .carlsbergensis ư c nuôi c y l c 220 vòng/phút, t i nhi t phòng, pH c a sinh kh i nhi u nh t môi trư ng nuôi là 6 giá tr m t xác quang OD620nm Thí nghi m 2: xác • nh th i gian thích h p cho sinh trư ng b ng cách o các th i i m sau: 24h, 28h, 32h, 36h, 40h nh pH môi trư ng nuôi c y thích h p pH môi trư ng có ý nghĩa quy t nh nt c sinh trư ng, phát tri n c a h u h t các vi sinh v t nói chung và S .carlsbergensis. .. Sau khi ch n ư c môi trư ng t nhiên thí nghi m 4, ti n hành nghiên c u t l cơ ch t pha môi trư ng d ch nuôi c y tăng sinh v i các t l là: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% trong 1000ml d ch môi trư ng, ti p ó em MT kh trùng 1210C trong 20 phút, 1atm, ngu i r i c y S .carlsbergensis nuôi c y l c 220 vòng/phút, th i gian nuôi, pH môi trư ng nuôi, nhi t 3 D ch sau nuôi c y em xác nuôi nghiên c u nh giá tr m t... trình: − Saccharomyces carlsbergensis ông khô ư c nh n t B sưu t p gi ng vi sinh v t c a Vi n Công Ngh Sinh H c trư ng − i h c Bách Khoa – Hà N i Chu n b môi trư ng Hansen d ch th pha như ph n môi trư ng nuôi c y vi sinh cho vào bình tam giác 250ml kho ng 100ml d ch th , r i kh trùng trong 20 phút, − 1210C ngu i C y S .carlsbergensis ông khô: l y 1 vòng que c y S .carlsbergensis ông khô cho vào môi trư... sinh là kho ng 4.2 ÷ 6.2 N m men S .carlsbergensis ư c nuôi c y l c 220 vòng/phút, t i nhi t phòng trong th i gian nuôi c y nghiên c u thí nghi m 1, môi trư ng nuôi c y ư c i u ch nh pH là: 4 – 4.5 – 5 – 5.5 – 6 – 6.5 Xác nh pH môi trư ng nuôi thích h p cho sinh trư ng b ng cách xác tr m t quang • Thí nghi m 3: xác nh nhi t nh giá nuôi c y thích h p S .carlsbergensis ư c nuôi c y l c 220 vòng/phút, 280C,... và pH môi trư ng nuôi xác các nhi t nh 200C, 240C, các thí nghi m 1, 29 2 Xác nh nhi t thích h p cho sinh trư ng b ng cách xác nh giá tr m t quang 2.3.2.4 Thí nghi m xác nh i u ki n nuôi c y tăng sinh kh i b ng MTTN Môi trư ng t nhiên ư c pha như m c 2.3.2.1 r i ti n hành các thí nghi m 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, xác nh các i u ki n thích h p cho nuôi c y tăng sinh kh i S .carlsbergensis b ng môi trư... gian 20 phút nhi t Môi trư ng t nhiên có b sung thêm các ch t dinh dư ng c n thi t Sau khi ti n hành thí nghi m tìm ư c môi trư ng t nhiên thích h p, ti n hành pha môi trư ng có b sung thêm các ch t dinh dư ng nghiên c u b sung vào môi trư ng nuôi c y tăng sinh a Nguyên t c c a vi c ch t o môi trư ng: D a trên cơ s nhu c u v các ch t dinh dư ng và kh năng dinh dư ng c a t ng lo i vi sinh v t so sánh... i thi u v ng d ng c a sinh kh i vi sinh v t Công ngh thu sinh kh i vi sinh v t là các quá trình nuôi c y các ch ng thu n khi t ho c h n h p vài ch ng thu kh i lư ng t bào khi sinh trư ng v i các c i m sau: − Sinh kh i làm ngu n protein dùng trong dinh dư ng ng v t là nh ng t bào vi sinh v t, k c sinh kh i t o, ã s y khô và ch t, giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng ch t Ngu n sinh kh i này ư c g i . dụng môi trường tự nhiên trong việc nuôi sản xuất sinh khối nấm men để sản xuất sinh khối nấm men dùng trong chăn nuôi chúng tôi tiến hành: Thử nghiệm nuôi sản xuất sinh khối Saccharomyces carlsbergensis. môi trường MTTN: môi trường tự nhiên MT1: môi trường nước chiết bột ngô MT2: môi trường nước chiết cám gạo MT3: môi trường nước chiết bắp cải MT4: môi trường nước chiết khoai tây MT5: môi. S .carlsbergensis 46 4 3.2.7. Xác định pH nuôi tăng sinh khối S .carlsbergensis 47 3.3. THỬ NGHIỆM LÀM KHÔ SINH KHỐI NẤM MEN 48 3.4. ĐỀ XUẤT NUÔI THU SINH KHỐI S .CARLSBERGENSIS 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN