1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN XUÂN KHÁNH HÀ PHỐI HỢP THỬ NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ CHẤT LƯỢNG VẮCXIN THÀNH PHẦN (BẠCH HẦU - UỐN VÁN - HO GÀ VIÊM MÀNG NÃO Hib - VIÊM GAN B) ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS LÊ VĂN BÉ ThS DƯƠNG HỮU THÁI Nha Trang, 2009 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực tập làm đồ án tốt nghiệp này, nhận hướng dẫn tận tình chu đáo TS Lê Văn Bé – Viện phó Viện Vắc xin Nha Trang ThS Dương Hữu Thái – phó phòng Thành phẩm Viện Vắc xin Nha Trang, người thầy nhiệt tâm truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Đồng thời, nhận nhiệt tình bảo, lời động viên, giúp đỡ cô chú, anh chị phòng Thành phẩm, phòng Kiểm định Viện Vắc xin Nha Trang Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu Tơi xin tỏ lòng tri ân sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Môi Trường, đặc biệt quan tâm Ban Chủ nhiệm ngành Công nghệ Sinh học, tất thầy cô dạy dỗ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập Cuối tơi xin gửi tình cảm thân thương tới gia đình, bạn bè quan tâm, đồng hành giúp đỡ năm tháng làm sinh viên Trường Đại học Nha Trang Nha Trang, tháng năm 2009 Sinh viên thực hiện, Nguyễn Xuân Khánh Hà CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAFP Hiệp hội Các bác sĩ gia đình - Mỹ (American Academy of Family Physicians) AAP Viện Nhi khoa - Mỹ (American Academic of Pediatrics) ACIP Ban cố vấn thực hành tiêm chủng – Hoa Kỳ (The Advisory Committee on Immunization Practices) CTTCMR Chương trình tiêm chủng mở rộng DT Vắc xin bạch hầu, uốn ván DTP Vắc xin bạch hầu, uốn ván, ho gà (Diphtheria - Tetanus - Pertussis) DTPw Vắc xin bạch hầu – uốn ván – ho gà toàn tế bào (Diphtheria Tetanus – Pertussis whole cell) EPI Chương trình tiêm chủng mở rộng (Expanded Programe on Immunization) FDA Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm - Mỹ (Food and Drug Administration) GAVI Liên minh Vắc xin tiêm chủng toàn cầu (Global Alliance for Vaccines and Immunization) HBcAg Kháng nguyên lõi virus viêm gan B HBeAg Kháng nguyên e virus viêm gan B HBIG Globulin miễn dịch viêm gan virus B (Hepatitis B immunoglobulin) HBsAg Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B HeB Vắc xin viêm gan B virus viêm gan B (Hepatitis B Virus HBV) Hib Vắc xin viêm màng não Hib (Haemophilus influenzae type b) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) IVAC Viện Vắc xin Nha Trang Lf/mgNP Đơn vị lên bông/ mg nitơ protein (Limes flocculation/mg nitrogen protein) Lf/ml Đơn vị lên bông/ml (Limes flocculation/ml) MHC Phức hợp hòa hợp tổ chức MMR Vắc xin phòng sởi – quai bị - rubella (Measles – Mumps – Rubella) PBS Dung dịch đệm Phosphate Buffered Saline PRP Tên kháng nguyên Hib - polysaccharide (polyribosyl- ribitol phosphate) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) TFF Màng lọc dòng chảy tiếp tuyến VGB Bệnh viêm gan B DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các ngưng kết nguyên hồng cầu loài thuộc giống Bordetella Bảng 3.1: Hấp phụ giải độc tố Bạch hầu lên tá chất AlPO4 theo thời gian Bảng 3.2: Hấp phụ giải độc tố Uốn ván lên tá chất AlPO4 theo thời gian Bảng 3.3: Hấp phụ kháng nguyên viêm gan B lên tá chất AlPO4 theo thời gian Bảng 3.4: Hấp phụ kháng nguyên viêm màng não Hib lên tá chất AlPO4 theo thời gian Bảng 3.5: Thời gian hấp phụ tối ưu thành phần kháng nguyên lên tá chất AlPO4 Bảng 3.6: Kết đánh giá cảm quan lô vắc xin IVACPENTA Bảng 3.7: Kết kiểm tra vô trùng lô vắc xin IVACPENTA Bảng 3.8: Trọng lượng tăng trung bình chuột sau ngày tiêm Bảng 3.9: Kết kiểm tra an toàn đặc hiệu thành phần bạch hầu, uốn ván Bảng 3.10: Kết kiểm tra an tồn chung lơ vắc xin IVACPENTA Bảng 3.11: Kết kiểm tra thành phần hóa học lô vắc xin IVACPENTA Bảng 3.12: Kết kiểm tra pH lô vắc xin IVACPENTA theo thời gian Bảng 3.13: Kết nhận dạng thành phần bạch hầu, uốn ván, ho gà Bảng 3.14: Kết kiểm tra độ hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, Hib, HeB lô vắc xin IVACPENTA DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc độc tố bạch hầu Hình 1.2: Cấu trúc độc tố uốn ván Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc độc tố ho gà Hình 2.1: Sản phẩm vắc xin thành phần IVACPENTA IVAC sản xuất Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn độ hấp phụ giải độc tố Bạch hầu lên tá chất AlPO4 theo thời gian Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn độ hấp phụ giải độc tố Uốn ván lên tá chất AlPO4 theo thời gian Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn độ hấp phụ kháng nguyên viêm gan B lên tá chất AlPO4 theo thời gian Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn độ hấp phụ kháng nguyên viêm màng não Hib lên tá chất AlPO4 theo thời gian Hình 3.5: So sánh độ hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, Hib, HeB lô vắc xin IVACPENTA MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÁC BỆNH VÀ VẮC XIN 1.1.1 Bệnh bạch hầu, vắc xin bạch hầu 1.1.2 Bệnh uốn ván, vắc xin uốn ván 1.1.3 Bệnh ho gà, vắc xin ho gà 11 1.1.4 Bệnh viêm màng não Hib, vắc xin Hib 16 1.1.5 Bệnh viêm gan B, vắc xin HeB 20 1.2 TÁ CHẤT NHÔM 23 1.2.1 Định nghĩa tá chất 23 1.2.2 Cơ chế hoạt động tá chất 23 1.2.3 Vai trò tá chất 24 1.2.4 Tá chất nhôm 24 1.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN NHIỀU THÀNH PHẦN 26 1.3.1 Phối hợp vắc xin nhiều thành phần 26 1.3.2 Tình hình sử dụng vắc xin phối hợp Thế giới 28 1.3.3 Vắc xin phối hợp nhiều thành phần Việt Nam .29 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Sinh phẩm 30 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 30 2.1.3 Chế phẩm chuẩn 30 2.1.4 Dung dịch chuẩn hóa chất 30 2.1.5 Súc vật thí nghiệm 31 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Khảo sát thí nghiệm thời gian hấp phụ thành phần 31 2.2.2 Sản xuất thử nghiệm 32 2.3 ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ CHẤT LƯỢNG VẮC XIN THÀNH PHẦN 34 2.3.1 Cảm quan, thường qui IVAC 34 2.3.2 Phương pháp kiểm tra vô trùng, thường qui IVAC .34 2.3.3 Phương pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu, thường qui IVAC 34 2.3.4 Phương pháp kiểm tra an tồn chung (an tồn khơng đặc hiệu), thường qui IVAC 35 2.3.5 Phương pháp kiểm tra hóa học, thường qui IVAC .35 2.3.6 Phương pháp kiểm tra nhận dạng vắc xin DTP, thường qui IVAC 36 2.3.7 Phương pháp xác định độ hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, thường qui IVAC 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .38 3.1 KẾT QUẢ 38 3.1.1 Kết xác định độ hấp phụ thành phần theo thời gian .38 3.1.2 Kết kiểm định lô vắc xin IVACPENTA 42 3.2 BÀN LUẬN 47 3.2.1 Thời gian hấp phụ thành phần 47 3.2.2 Kết sản xuất 48 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm màng não type b (Hib) viêm gan B nguyên vi sinh vật virus gây bệnh tử vong cao trẻ em, vắc xin vũ khí hiệu việc kiểm soát bệnh tật Tuy vắc xin phối hợp sử dụng toàn giới vài thập kỉ, vắc xin phòng ngừa hiệu bệnh viêm gan B Hib trở nên sẵn dùng vài năm gần dần tiếp nhận vào chương trình tiêm chủng nhiều nước Một khía cạnh quan trọng chương trình chủng ngừa thành cơng chấp nhận vắc xin trẻ em cha mẹ Vắc xin phối hợp không cho phép quản lý đồng thời số kháng nguyên, làm mũi tiêm giảm đến mức tối thiểu đau đớn cho trẻ em, mà chúng cịn làm đơn giản hóa làm giảm tổng chi phí chương trình tiêm chủng Hiện nay, xu hướng nước giới phối hợp nhiều loại vắc xin vào mũi tiêm nhằm đơn giản hóa cơng tác tiêm phịng, làm giảm số lần tiêm, có nghĩa giảm số lần cha mẹ phải đưa tiêm, giảm số lần bỏ tiêm quên không ngày, giảm đau cho trẻ giảm phản ứng phụ xảy Việc phát triển vắc xin phối hợp thành phần bệnh bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm gan B Hib bước tiến lớn theo yêu cầu vắc xin cải tiến trở thành phương tiện để bổ sung vắc xin viêm gan B Hib vào chương trình tiêm chủng tồn giới Giá cịn đắt cản trở trước cho việc sử dụng vắc xin phối hợp nước phát triển Nếu tự sản xuất vắc xin phối hợp nhiều thành phần giá thành thấp nhiều so với nhập ngoại, giúp người dân tiếp cận dễ dàng Trong vòng năm gần đây, nhiều nhà sản xuất thành công việc hỗn hợp vắc xin cộng hợp viêm màng não type b (Hib) vắc xin viêm gan B (HeB) với vắc xin phối hợp bạch hầu, uốn ván, ho gà (DTP) tạo vắc xin nhiều thành phần vắc xin DTP- Hib- HeB, DTP- Hib, DTP- HeB 10 Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) , chương trình vắc xin miễn dịch toàn cầu khuyến cáo sử dụng vắc xin Hib, HeB Chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) Việt Nam tự túc sản xuất sử dụng vắc xin DTP cho chương trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia 15 năm qua, thực đề tài cấp nghiên cứu sản xuất vắc xin DTP- Hib Vì vậy, việc đặt vấn đề nghiên cứu phối hợp thử nghiệm vắc xin thành phần DTP- Hib- HeB cần thiết để xây dựng qui trình sản xuất vắc xin phục vụ cho công tác tiêm phòng Xuất phát từ ý nghĩa khoa học thực tiễn đối tượng nghiên cứu thực đề tài: “Phối hợp thử nghiệm đánh giá sơ chất lượng vắc xin thành phần (Bạch hầu - Uốn ván - Ho gà - Viêm màng não Hib - Viêm gan B)” Với mục tiêu: Xác định cách thức hấp phụ thành phần hoạt tính vắc xin lên tá chất AlPO4 bảo đảm dạng vật lý tốt Đánh giá sơ chất lượng vắc xin thành phần DTP- Hib- HeB theo tiêu chuẩn Quốc tế Việt Nam 54 3.1.2.7 Kết kiểm tra độ hấp phụ bạch hầu, uốn ván IVAC thực hiện; Hib, HeB Cuba thực Bảng 3.14: Kết kiểm tra độ hấp phụ thành phần D, T, Hib, HeB lô vắc xin IVACPENTA Lơ thí nghiệm Thành phần Bạch hầu Uốn ván Hib HeB 0109 80 71 84 82 0209 79 74 86 80 0309 82 75 83 80 Tiêu chuẩn Việt Nam ≥ 60% Độ hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, Hib HeB lên tá chất AlPO4 Đ ộ h ấ p p h ụ (% ) lô vắc xin 60%, đạt tiêu chuẩn Việt Nam 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 D T Lô 0109 Thành phần Lô 0209 H ib H eB Lơ 0309 Hình 3.5: So sánh độ hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, Hib, HeB lô vắc xin IVACPENTA 55 Độ hấp phụ thành phần lô vắc xin tương đối nhau, khơng có chênh lệch nhiều Thành phần bạch hầu có độ hấp phụ cao lơ 0309 với 82%, thấp lô 0209 với 79% Thành phần uốn ván lơ 0309 có độ hấp phụ cao 75%, thấp lô 0109 71% Thành phần Hib có độ hấp phụ cao thành phần với lô 0209 đạt tới 86%, thấp lơ 0309 83% Thành phần HeB có độ hấp phụ cao 81% lô 0109 Độ hấp phụ trung bình thành phần bạch hầu 80,3%, thành phần uốn ván 73,3%, thành phần Hib 84,3%, thành phần HeB 80,7% 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Thời gian hấp phụ thành phần Thí nghiệm khảo sát thời gian hấp phụ tối ưu thành phần bạch hầu, uốn ván, ho gà, HBsAg, PRP-T thực điều kiện hấp phụ cố định với nhiệt độ 20ºC - 25ºC, pH 6,5 – 6,8 , tốc độ khuấy 150 – 200 vòng/phút Đây điều kiện thuận lợi cho hấp phụ lên tá chất AlPO4 Xác định thời gian tối ưu hấp phụ thành phần lên tá chất có ý nghĩa quan trọng việc xác định cách thức hấp phụ chúng quy trình hỗn hợp, thời gian dài gây lãng phí thời gian kéo dài thời gian hỗn hợp làm tăng nguy bị nhiễm vi sinh vật Cụ thể thời gian hấp phụ tối ưu cho thành phần bạch hầu giờ, uốn ván giờ, kháng nguyên HBsAg viêm gan B giờ, kháng nguyên PRP-T viêm màng não Hib Cách thức hấp phụ thành phần hoạt tính vào tá chất AlPO4 thành phần ho gà toàn thân vào vắc xin phối hợp thực theo sơ đồ quy trình nêu cho sản phẩm cụ thể IVACPENTA sử dụng thành phần ho gà tồn tế bào để làm vắc xin có tính kháng ngun mạnh, có đầy đủ yếu tố chất sinh miễn dịch, tính lạ, trọng lượng phân tử lớn (tồn xác tế bào) cấu trúc phức tạp với nhiều kháng nguyên bề mặt Thành phần ho gà sử dụng giá thể để gắn nhiều kháng nguyên khác, ta khảo sát thời gian hấp phụ thành phần hoạt tính lên tá chất AlPO4 mà không thực với thành phần ho gà 56 Quá trình hỗn hợp điều kiện phòng sạch, laminar class 100 với thơng số kỹ thuật kiểm sốt chặt chẽ Tổng thời gian hỗn hợp vắc xin IVACPENTA 24 giờ, q trình hỗn hợp pH ln kiểm sốt khoảng 6,5 – 6,8, nhiệt độ phòng 20ºC - 25ºC Trong trình khuấy tránh tạo bọt đảm bảo thành phần hỗn dịch phải đồng đều, tốc độ khuấy điều chỉnh khoảng 150 – 200 vòng/phút 3.2.2 Kết sản xuất Cảm quan: Sau sản xuất theo dõi qua tháng, tháng cho thấy lô vắc xin IVACPENTA có dạng vật lý tốt, khơng vón, khơng tạo hạt hay kết tủa, khơng có cặn hay lẫn chất lạ khó hịa tan, sau lắc nhẹ nhanh chóng hịa thành hỗn dịch đồng Dạng vật lý tốt cho thấy kháng nguyên thành phần hỗn hợp có tương thích với Sản phẩm dạng lỏng, tránh để đông đá bảo quản điều kiện +2ºC - +8ºC, qua bảng 3.6 ta thấy vắc xin IVACPENTA có dạng vật lý ổn định sau tháng sản xuất Vơ trùng: Các lơ thí nghiệm đạt kiểm tra vô trùng chứng tỏ vắc xin sản xuất đảm bảo điều kiện phịng sạch, kiểm sốt vi khí hậu chặt chẽ, laminar class 100, kỹ thuật thiết bị trợ giúp đảm bảo quy trình sản xuất thực khuyến cáo An tồn đặc hiệu: Tất lơ thí nghiệm có kết đạt tiêu chuẩn an tồn đặc hiệu, chuột thí nghiệm khơng có dấu hiệu nhiễm độc bạch hầu, uốn ván, sống khỏe mạnh lên cân, điều khẳng định lô giải độc tố bạch hầu, uốn ván, ho gà đạt tiêu chuẩn an toàn đặc hiệu để sử dụng sản xuất vắc xin Các thành phần Hib, HeB kiểm tra an toàn đặc hiệu Cuba An toàn chung: Vắc xin sản xuất sử dụng cho người, liên quan trực tiếp đến tính mạng người việc kiểm tra độ an tồn cần thiết Kết kiểm tra an toàn chung cho thấy lô vắc xin IVACPENTA đạt tiêu chuẩn, biến động tỷ lệ tăng trọng súc vật thí nghiệm lơ nằm giới hạn cho phép, chứng tỏ lô vắc xin đạt tính an tồn theo TCVN 908-91 TCYTTG 57 Hóa học: Từ bảng 3.1 cho thấy lô vắc xin pha chế với công thức thành phần hóa học nhau, tiêu chuẩn TCYTTG tiêu chuẩn sở Trong hàm lượng NaCl dao động quanh giá trị 0,9%, nằm khoảng 0,71,0% đạt tiêu chuẩn TCYTTG Hàm lượng AlPO4 lô 2,69 mg/ml, 2,75 mg/ml, 2,74 mg/ml, giá trị phù hợp với tính tốn ban đầu hàm lượng AlPO4 vắc xin 2,7 mg/ml Formaldehyde tồn dư dạng vết cho thấy trình tinh chế giải độc tố thực tốt, loại trừ hoàn toàn Formaldehyde, đảm bảo vắc xin sạch, không gây độc Hàm lượng merthiolate nằm giới hạn cho phép, mức thấp 0,005% Nhận dạng: Kết kiểm tra nhận dạng cho thấy lơ vắc xin có mặt thành phần bạch hầu, uốn ván, ho gà Độ hấp phụ: Khơng có chênh lệch nhiều độ hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, Hib, Heb lô vắc xin, độ hấp phụ 60%, đạt tiêu chuẩn Việt Nam vắc xin hấp phụ tá chất AlPO4 Độ hấp phụ thành phần bạch hầu cao uốn ván, Hib có độ hấp phụ cao nhất, phù hợp với kết khảo sát thành phần riêng biệt pH: Tiêu chuẩn TCYTTG cho phép vắc xin có pH từ 6,0 - 7,0 giới hạn giúp cho sản phẩm giữ tính ổn định thành phần phù hợp với tiêu chuẩn cho phép loại thuốc tiêm nói chung lơ sản xuất có pH từ 6,6 - 6,8, tương đương với pH sản phẩm DTP DTP-Hib IVAC nghiên cứu sản xuất trước Kết đo pH lô sau sản xuất, sau tháng, sau tháng bảo quản nhiệt độ +2ºC - +8ºC bảng 3.12 cho thấy lơ vắc xin có pH ổn định 58 KẾT LUẬN Qua thí nghiệm khảo sát xác định thời gian tối ưu để hấp phụ thành phần bạch hầu, uốn ván, Hib, HeB lên tá chất AlPO4, bước đầu xác định cách thức hỗn hợp thử nghiệm vắc xin thành phần, tổng thời gian cho trình hỗn hợp 24 Đã sản xuất lô vắc xin IVACPENTA đạt tiêu chuẩn cho phép TCYTTG TCVN tiêu kiểm định: - Cảm quan - Kiểm tra vơ trùng - An tồn đặc hiệu - An tồn chung - Hóa học - Nhận dạng - Độ hấp phụ KIẾN NGHỊ Thực kiểm tra công hiệu thành phần vắc xin IVACPENTA tiếp tục theo dõi độ hấp phụ, pH tiêu khác đến hết thời gian sử dụng vắc xin 59 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Dược điển Việt Nam (2002), Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Hiệp (2004), Vắc xin ho gà miễn dịch công nghệ, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Hiệp (2006), Vắc xin học vấn đề bản, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Kê (chủ nhiệm đề tài) (2001), Nghiên cứu sản xuất vắc xin cộng hợp Hib để sản xuất vắc xin DTP – Hib hấp phụ Đề tài cấp bộ, Bộ Y Tế Dương Hữu Thái (2004), Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất vắc xin uốn ván liều chất bảo quản merthiolate Viện Vắc xin Nha Trang Luận văn thạc sĩ y học, Trường Đại học Y, Hà Nội Viện Vắc xin (2002), Hồ sơ tái đăng ký vắc xin bạch hầu – ho gà – uốn ván (DPT), lần xuất thứ ba, Lưu hành nội Viện Vắc xin Nha Trang (2003), Bệnh bạch hầu vắc xin phòng bệnh Tài liệu tham khảo dành cho cán y tế, Nha Trang Viện Vắc xin Nha Trang – Công ty vắc xin sinh phẩm số (2003), Hội thảo khoa học “Vắc xin – Huyết thanh”, Nha Trang Huỳnh Thị Thanh Xuân (2007), Xây dựng quy trình hấp phụ tá chất Al(OH)3 sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Đà Lạt 10 Nguyễn Thị Thế Yến (2000), Nghiên cứu sản xuất vắc xin mẫu chuẩn Bạch hầu – Ho gà – Uốn ván Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 American academy of pediatrics (1999), Combination vaccines for childhood immunization: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization 61 Practices (ACIP), the American Academy of Pediatrics (AAP), and the American Academy of Family Physicians (AAFP) Pediatrics May 1999 12 CIGB, Application for registration of drugs/ cosmetics, Product name: Quimi – Hib, Product particulars, trang 1-2 13 Daisy Dodd, MD (2003), Benefits of Combination Vaccines: Effective Vaccination on a Simplified Schedule The American journal of managed care January 2003, 6-12 14 Heikki Peltola (1991), Haemophilus influenzae type b in the world – an evolving view In: Combined vaccines for the world’s children, Progress towards implementing hepatitis B and Haemophilus influenzae type b into childhood immunization programmes Proceedings of a meeting held in Barcelona, 28-29 June 1999 Editorial board: S Dittmann, T Szucs 15 Centers for Disease Control and Prevention (2007), Hib disease, Immunization Action Coalition (www.immunization.org), April 2007 16 Centers for Disease Control and Prevention (2007), Hib vaccine, Immunization Action Coalition (www.immunization.org), April 2007 17 Dr Rudy H Tiesjema (1998), Backgrounds of production of DTP group vaccines, RIVM, Vaccine technology transfer centre 18 Sieghart Dittmann, Introduction In: Combined vaccines for the world’s children: Progress towards implementing hepatitis B and Haemophilus influenzae type b into childhood immunization programmes Proceedings of a meeting held in Barcelona, 28-29 June 1999 Editorial board: S Dittmann, T Szucs 19.WHO.INT, Haemophilus influenzae type b, Vaccines, Immunization and Biologicals 23/9/01 20 WHO.INT, Hepatitis B, Vaccines, Immunization and Biologicals 23/9/01 TÀI LIỆU INTERNET 21 Siêu vi B ung thư gan (07/06/2009) Thông tin Y dược Việt Nam http://www.cimsi.org.vn/ ChuyenTrang/?newsId=3829 62 PHỤ LỤC Phụ lục XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÔM (Al3+) TRONG VẮC XIN Nguyên tắc Phương pháp dựa phản ứng tạo thành phức chất lượng thừa dung dịch muối natri acid ethylen diamin tetra acetic (EDTA) với ion nhơm (Al3+), sau chuẩn độ lượng EDTA thừa dung dịch CuSO4 0,01M Tiến hành Làm tiêu song song ống nghiệm đun nóng + Tiêu (mẫu thử) 1ml H2SO4 đặc + giọt HNO3 + 3ml vắc xin thử + Tiêu (mẫu trắng) 1ml H2SO4 đặc + giọt HNO3 + 3ml nước cất Đun nóng tiêu đến có khói trắng Tiếp tục đun nóng cho thêm vài giọt HNO3 dung dịch ống nghiệm màu, để nguội thêm 10 ml nước cất Nếu dung dịch đục tiếp tục đun đến Thêm NaOH 50% vào ống nghiệm, dùng thị màu methyl da cam có màu đỏ vàng Hịa tan tủa cách cho thêm dung dịch H2SO4 loãng Chuyển hỗn dịch ống nghiệm sang bình nón, tráng ống nghiệm 25 ml nước cất cho vào bình tam giác Thêm vào bình 25 ml dung dịch EDTA, đun sơi nhẹ phút thêm ml thị màu pyridin azonaphtol Chuẩn độ dung dịch CuSO4 xuất màu tía Tính kết quả: 3+ (N – n) x 0,2698 x 4,52 Al (mg/ml) = N : Lượng dung dịch CuSO4 0,01M dùng chuẩn độ mẫu trắng (ml) n : Lượng dung dịch CuSO4 0,01M dùng chuẩn độ mẫu thử (ml) 63 0,2698 : Lượng Al3+ tương đương với ml CuSO4 (mg) 4,52 : Lượng AlPO4 tương đương với mg Al3+ (mg) : Lượng mẫu phân tích Tiêu chuẩn Hàm lượng nhôm (Al3+) thành phần không 1,25 mg/liều (tiêu chuẩn Việt Nam 905-1992 TCYTTG) 64 Phụ lục XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FORMALDEHYDE TỰ DO TRONG VẮC XIN Nguyên tắc Định lượng formaldehyde cách đo cường độ màu 3,5 diacetyl 1,4 dihydrothydin bước sóng 410 nm Phức hợp tạo thành có màu vàng chanh phản ứng formaldehyde tự mẫu kiểm tra với acetylaceton amoni môi trường acid nhẹ Tiến hành - Ly tâm 40 ml mẫu thử 3000 vòng/phút, phút - Hút ml dung dịch mẫu thử cho vào ống nghiệm (làm song song ống cho mẫu kiểm tra) - Xây dựng đường chuẩn: Cho vào ống nghiệm 0; ; ; ; ; ; 0,4 ; 0,8 ; 1,2 ; 1,6 ; 2,0 ml dung dịch chuẩn formaldehyde 2µg/ml Hàm lượng formaldehyde tương ứng ống ; 0,8 ; 1,6 ; 2,4 ; 3,2 ; 4,0 µg/ml - Thêm nước cất vừa đủ ml vào ống nghiệm - Thêm ml dung dịch acetylaceton (pH = 6) vào ống nghiệm - Đun cách thủy 37ºC 50 phút, dung dịch có màu vàng chanh - Lấy để nguội đến nhiệt độ phịng - Đo quang phổ bước sóng 410 nm Tính kết - Dựng đường chuẩn, dựa vào đường chuẩn để tính nồng độ formaldehyde mẫu kiểm tra a x 100 Formaldehyde (g%) = 1.000.000 a : Số µg formaldehyde mẫu tính theo đường chuẩn 100 : Tính theo tỷ lệ phần trăm 1.000.000 : Đổi đơn vị từ µg sang g 65 Tiêu chuẩn Hàm lượng formaldehyde tự vắc xin không 0,02% (tiêu chuẩn Việt Nam 905-1992 TCYTTG) 66 Phụ lục XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NaCl TRONG VẮC XIN Nguyên tắc Dựa phản ứng xác định ion Cl- AgNO3 0,1N với thị màu K2CrO4 10% từ lượng AgNO3 tiêu thụ suy hàm lượng NaCl Tiến hành - Lắc 40 ml vắc xin mẫu thử - Hút 1ml dung dịch mẫu thử cho vào bình tam giác dung tích 100 ml - Thêm giọt K2CrO4 10%, lắc - Chuẩn độ dung dịch AgNO3 0,1N đến xuất màu đỏ gạch - Ghi số N ml dung dịch AgNO3 0,1N dùng Tính kết - ml dung dịch AgNO3 0,1N tương ứng với 5,85 mg NaCl N x 5,85 x 100 NaCl (g%) = 1.000 N : số mg AgNO3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu thử 100 : tính theo tỷ lệ phần trăm 1.000.000 : đổi đơn vị từ mg sang g Tiêu chuẩn Hàm lượng NaCl vắc xin từ 0,7 – 1,0 % (tiêu chuẩn Việt Nam 905-1992 TCYTTG) 67 Phụ lục CHUẨN BỊ DUNG DỊCH Cồn 70% Pha chế 1lít cồn 70% - Đong 729 ml cồn 96% ống lường 1L - Bổ sung 271 ml nước cất pha tiêm - Cho vào chai để sử dụng, dung dịch sử dụng không bị đục hay bị tủa, thường không ngày Dung dịch muối sinh lý 0,85% Pha chế 5L NaCl 0,85% - Cân 4,25 g NaCl - Cho vào cốc 250 ml - Hòa muối NaCl dung dịch nước cất pha tiêm khuấy đũa khuấy - Tráng nước cốc đong nước cất pha tiêm - Cho dung dịch vào chai 5L - Lấy mẫu kiểm tra ml Xác định pH mẫu (6,4 - 7,4) - Nếu pH không thuộc khoảng này, loại bỏ dung dịch trên, tiến hành pha lại - Đậy kín miệng chai - Tiệt trùng dung dịch Autoclave 121ºC/30’ - Dán nhãn: - Tên dung dịch - Lô số, theo SOP 2.53.150.05 - Ngày sản xuất - Hạn dùng (15 ngày sau tiệt trùng) - Thời gian bảo quản - Tên người pha Dung dịch PBS 8mM Chuẩn bị 1L - Cân g NaCl; 1,12 g Na2HPO4; 1,24 g NaH2PO4.2H2O - Cho loại vào cốc mỏ riêng 68 - Hòa tan nước cất pha tiêm, khuấy đũa khuấy - Sau hòa tan xong, rót dung dịch vào chai loại 1L - Tráng rửa cốc nước cất pha tiêm - Bổ sung nước cất vào chai cho đủ 1L - Lấy mẫu ml Xác định pH mẫu Nếu pH không nằm khoảng thiết lập (6,6 – 6,8), loại bỏ dung dịch tiến hành pha lại - Tiệt trùng dung dịch Autoclave 121ºC/ 30’ - Dán nhãn Dung dịch Merthiolate 10g/l Pha 10 ml - Cân 0,1 g Merthiolate - Hòa tan ml nước cất pha tiêm - Sau hòa tan hoàn toàn, cho dung dịch từ cốc đong vào ống lường 10 ml - Bổ sung nước cất pha tiêm cho đủ 10 ml - Lấy ml mẫu để xác định hàm lượng Merthiolate - Lọc vô khuẩn qua màng lọc 0,2 µm - Dán nhãn ... đánh giá sơ chất lượng vắc xin thành phần (Bạch hầu - Uốn ván - Ho gà - Viêm màng não Hib - Viêm gan B)? ?? Với mục tiêu: Xác định cách thức hấp phụ thành phần ho? ??t tính vắc xin lên tá chất AlPO4... thành công việc hỗn hợp vắc xin cộng hợp viêm màng não type b (Hib) vắc xin viêm gan B (HeB) với vắc xin phối hợp bạch hầu, uốn ván, ho gà (DTP) tạo vắc xin nhiều thành phần vắc xin DTP- Hib- ... cho hay 1-7 -2 009 sử dụng loại vắc xin để ngừa năm bệnh bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm gan B viêm màng não mủ cho trẻ em tuổi Trong số này, vắc xin ngừa viêm màng não mủ (Hib) lần đưa vào chương