- 1 - ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đã và đang trở thành mối quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã đưa ra những cảnh báo về tình trạng mất an toàn trong thực phẩm tiêu dùng. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân, trong đó 100 - 200 ca tử vong. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn do: thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất, thực phẩm bị biến chất, thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên…Xét về nguyên nhân do vi sinh vật, trong số các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thì vi khuẩn C. pefringens đã được nhiều tác giả nghiên cứu và xác định chúng là một trong những tác nhân phổ biến gây ngộc độc thực phẩm [25]. Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) là loại trực khuẩn, bắt màu Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn này ra làm 5 type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra những độc tố khác nhau và gây bệnh cho từng loại đối tượng khác nhau. Type A sản sinh độc tố Alpha, type B sản sinh các độc tố Alpha, Beta và Epsilon, type C sản sinh Alpha và Beta, type D sản sinh Alpha và Epsilon, type E sản sinh Alpha và Iota. Ngoài ra C. perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kapa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…[11]. Vi khuẩn C. perfringens tồn tại rất phổ biến trong tự nhiên: trong đất, nước, đặc biệt là trong đường ruột của động vật và con người [3]. Do đó chúng rất dễ dàng lây nhiễm vào trong thực phẩm và gây ngộ độc cho con người. Bệnh ngộ độc thực phẩm thường do các vi khuẩn type A và C đôi khi D gây ra. Các type này có thể sản sinh độc tố enterotoxin nguồn gốc nha bào kết hợp - 2 - với các tế bào thượng bì niêm mạc của phần cuối ruột non gây tổn hại cấu trúc màng tế bào gây đau bụng và tiêu chảy [11]. Thịt gà là một loại thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao và được sử dụng khá phổ biến trong bữa ăn hàng ngày của mỗi gia đình. Tuy nhiên cũng như các loại thực phẩm khác chúng rất dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật trong đó có vi khuẩn C. pefringens. Vì vậy, việc nghiên cứu tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trên thực phẩm nói chung và trên thịt gà nói riêng là rất cần thiết. Từ đó có thể kịp thời phản ánh tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm và có những biện pháp giảm thiểu vấn đề ngộ độc thực phẩm. Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban giám đốc Viện công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “PHÂN LẬP, GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC VÀ ĐỊNH TYPE ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN YẾM KHÍ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN THỊT GÀ TẠI MỘT SỐ CHỢ TRONG ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ NHA TRANG BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR”. Với mục tiêu là xác định tình trạng ô nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên thịt gà mà chúng tôi thu thập từ một số chợ bán lẻ trong địa bàn thành phố Nha Trang, từ đó đề ra những khuyến cáo về tình trạng nhiễm C. perfringens trên thịt gà. - 3 - CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nước và nước ngoài 1.1. Tình hình ngộ độc trong nước Ngộ độc thực phẩm là do ăn phải thức ăn có chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột và kết thúc nhanh chóng, khác với dịch bệnh là có thời gian tiến triển tăng dần và trước khi kết thúc có thời gian giảm dần xuống. Ngộ độc có những triệu chứng của một bệnh cấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, tiêu chảy…và kèm theo các triệu chứng khác tùy theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (trừ ngộ độc do C. botulinum lại gây táo bón do bị tê liệt thần kinh) [4]. Theo thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy trong 3 năm trở lại đây số người ngộ độc trong mỗi năm là rất lớn. Trong đó ngộ độc do nguyên nhân thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ lệ khá cao. Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây tổn thất lớn về sức khỏe mà còn thiệt hại rất lớn về kinh tế của mỗi quốc gia. Vì vậy, vấn đề kiểm soát ngộ độc thực phẩm của mỗi quốc gia là rất cần thiết, đặc biệt là vấn đề ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật. Bảng 1.1 Thống kê ngộ độc thực phẩm trong 3 năm [24]: Chỉ tiêu Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Số vụ ngộ độc 170 234 69 Số người mắc 7250 6896 4270 Số tử vong 63 123 15 Ngộ độc do vi sinh vật 29 87 26 Ngộ độc do độc tố 39 65 22 Ngộ độc do thực phẩm biến chất 8 19 4 Ngộ độc do thực phẩm hoá chất 22 18 1 - 4 - Qua bảng thống kê ở trên cho thấy tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta xảy ra nhiều và do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó đáng chú ý là số người tử vong do ngộ độc thực phẩm còn cao. Ngộ độc thực phẩm không chỉ ảnh hưởng đến sự an toàn và sức khỏe của cộng đồng mà còn ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân. Đòi hỏi các đoàn thể xã hội phải hợp tác chặt chẽ để hạn chế đến mức tối đa tình trạng ngộ độc thực phẩm như hiện nay. 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nơi trên thế giới Trong 3 thập niên trở lại đây, tình hình ngộ độc thực phẩm đã và đang là vấn đề nóng bỏng trên toàn thế giới. Ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở những nước đang phát triển mà cả ở những nước phát triển và gây ra nhiều tổn thất đáng lo ngại. Theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) [12] có khoảng 76 triệu người bị các bệnh lây truyền qua thực phẩm hàng năm ở Mỹ và gây thiệt hại khoảng 5 – 6 tỷ đô la, riêng chi phí cho bệnh lây truyền qua thực phẩm do Salmonella chiếm khoảng 1 tỷ đô la hàng năm về những chi phí y tế trực tiếp và gián tiếp. Tại Nhật Bản, theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh công bố năm 2004 [12], số người bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật lên tới 277 vụ, chiếm 45% trong số các vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước. Thiệt hại mỗi năm gần chục tỷ USD cho việc giải quyết những hậu quả của các vụ ngộ độc thực phẩm. Ở các nước phương tây, nhiễm C. perfringens là nguyên nhân thứ ba về ngộ độc thực phẩm phần lớn là do thực phẩm chưa được nấu chín. Trên đây là những con số sơ bộ về tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nước phát triển. Còn tại các nước đang phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm cũng đang diễn biến khá phức tạp và cũng gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng, trong đó có Việt Nam. - 5 - 2. Nguyên nhân và một số loại ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm thường do các nguyên nhân sau [4]: - Thức ăn bị ôi hỏng. - Bản thân thức ăn có chất độc. - Thức ăn bị nhiễm vi sinh vật. - Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thức ăn. 2.1. Ngộ độc thực phẩm do thức ăn bị ôi hỏng Trong quá trình bảo quản, nếu không đảm bảo vệ sinh hoặc không theo đúng yêu cầu kĩ thuật, các cất dinh dưỡng trong thức ăn sẽ bị các tác nhân như: vi sinh vật, hoá học, vật lý… phân hủy thành những chất có hại. Chẳng hạn như: các chất đạm bị phân hủy thành amoniac, hydrosulphua, các chất amin độc; Các chất béo có thể bị oxy hóa thành các peroxyt, aldehyd, cetol,…; Nitrat bị chuyển thành nitrit…Các chất này không những làm cho thức ăn có mùi khó chịu mà có thể còn gây ngộ độc cho người sử dụng [4]. 2.2. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bản thân có chất độc Một số động vật, thực vật bản thân nó có chứa trong tế bào những chất độc, hoặc trong điều kiện nào đó tiết ra chất độc có thể gây ra ngộ độc khi cơ thể người ăn phải. Ngộ độc loại này chia làm ba nhóm [4]: - Một số thực vật có chất độc: khoai tây nảy mầm, sắn, măng, hạnh nhân. Một số loại hạt, vỏ cây, rễ cây có chứa saponin có tính chất tán huyết, phá hủy hồng cầu, tăng huyết áp, tăng sự hấp thụ và tác dụng của các alkanoid vào cơ thể,… - Một số động vật có chất độc: Loài nhuyễn thể Mytilus oedulis (chứa chất độc mytilotoxin gây chóng mặt, nôn mửa, ỉa chảy, buồn tay chân, không kiểm soát được cơ vận động dần dần dẫn đến tê liệt, tử vong); Loài cóc (có chứa chất độc bufogin, bufidin trong đó bufonin, bufotalin đều có nhân sterolic. Các chất độc này có tính chất kích thích mạnh niêm mạc gây tê liệt); Loài cá nóc (có chứa chất độc tetrodonin, acid tetrodonic, tetrodotoxin (trong buồng trứng) và - 6 - hepatoxin (trong gan). Ngộ độc gây tê liệt dần dần các cơ sau đó dẫn đến tử vong). - Ngộ độc do ăn phải nấm độc: do người sử dụng chưa biết rõ nguồn gốc ăn phải. 2.3. Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thực phẩm Có rất nhiều loại hóa chất cho vào thực phẩm với các mục đích khác nhau như các chất sát khuẩn, chất kháng sinh, chất chống oxy hóa hóa, chất bảo quản… có thể gây ngộ độc cho người ăn. Ví dụ: các chất thêm vào với mục đích tăng tính hấp dẫn như chất làm ngọt nhân tạo, hương liệu, các phẩm màu. Hoặc các chất thêm để chế biến đặc biệt như: sử dụng các hóa chất làm tăng độ sáng bóng, độ dai, độ giòn của thực phẩm. Hoặc các hóa chất lẫn vào thực phẩm trong quá trình chế biến, bảo quản, phân phối, hoặc tồn tại trong thức ăn do xử lý nông nghiệp, xử lý trong thời gian tàng trữ, bảo quản trong kho tàng hoặc những chất độc có sẵn hoặc do chuyển hóa sinh ra. Tất cả những chất này đều có thể trở thành chất độc nếu sử dụng liều lượng vượt quá cho phép với giới hạn an toàn sức khỏe của con người [4]. 2.4. Ngộ độc do vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật Thông thường các vi sinh vật khi nhiễm vào thực phẩm chúng tiết độc tố gây ngộ độc cho người sử dụng. Độc tố của vi sinh vật có thể có bản chất protein hoặc không, được sản xuất bởi vi khuẩn nhằm tiêu diệt các tế bào vật chủ [6]. Độc tố do vi sinh vật sinh ra được chia làm hai loại: Ngoại độc tố (exotoxin): là chất độc được sinh ra trong tế bào rồi tiết ra ngoài tế bào. Các ngoại độc tố có tính độc cao đối với cơ thể động vật [6]. Nội độc tố (endotoxin): là độc tố được tạo thành liên kết với các thành phần của tế bào vi sinh vật, chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào chết hoặc bị phân hủy. Nội độc tố có tính độc yếu hơn ngoại độc tố nhưng bền nhiệt (ở nhiệt độ sôi của nước độc tố không bị mất hoạt tính) [6]. Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn có độc tố của vi sinh vật mà không cần có mặt các tế bào sống của chúng. Ngộ độc thức ăn trong trường - 7 - hợp này là ngộ độc do độc tố vi sinh vật điển hình, thường là do ăn phải một lượng lớn ngoại độc tố có trong thức ăn [6]. Ngộ độc do ăn phải một lượng lớn vi sinh vật chủ yếu là do vi khuẩn trong thức ăn khi vào trong cơ thể chúng tiếp tục sinh trưởng, phát triển và sản sinh độc tố. Trong cơ thể chúng tiết độc tố hoặc khi bị chết sinh khối của chúng tự phân giải và giải phóng độc tố gây ngộ độc. Ngộ độc dạng này gọi là ngộ độc thức ăn có điều kiện hay là ngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn [6]. 3. Một số vi sinh vật thường gây ngô độc thực phẩm. Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis và Salmonella enteritidis ngoài ra còn có các loại Salmonella thompson, Salmonella derby, Salmonella newport,…Salmonellae là loại trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, lên men đường glucose sinh hơi, thường không lên men đường lactose, sucrose. Nhiệt độ tối thích để chúng phát triển là 37 0 C, khoảng pH dành cho sự phát triển là 4,1 – 9,0. Khả năng chịu nhiệt độ và phát triển phụ thuộc vào loại thực phẩm và type huyết thanh. Vi khuẩn bị tiêu diệt ở 66 0 C ít nhất là 12 phút hoặc 60 0 C trong 78 – 83 phút, trong sữa trứng là 81,5 0 C trong 3 phút. Điều kiện cần thiết để ngộ độc do Salmonellae bộc phát là: (1) thực phẩm phải chứa hoặc nhiễm vi khuẩn; (2) thực phẩm phải là môi trường tốt để vi khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở; (3) vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa. Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết. Do đó trong thời kì đầu, lấy máu người bệnh cấy truyền sẽ phát hiện vi khuẩn. Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột tiết ra độc tố. Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu. Ngoài ra, vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố. Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm tăng độ bền của thành mao quản và giảm chức năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể. - 8 - Triệu chứng gây bệnh: triệu chứng bộc lộ phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ vi khuẩn nhiễm vào thực phẩm. Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có khi vài giờ nhưng có khi vài ngày. Triệu chứng trước tiên là nhức đầu, chán ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy. Thân nhiệt tăng lên 38-40 0 C trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát hiện bệnh và tùy theo mức độ nặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày. Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày ruột [10]. Ngộ độc do vi khuẩn E. coli E. coli là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. E. coli gây bệnh thường gặp trên thú non, trẻ em, nhiễm trùng huyết ở trẻ sơ sinh. Còn gây ngộ độc thực phẩm có thể là do các type gây bệnh phát triển mạnh mẽ trong thức ăn, đó là các serotype: O 3 , O 4 , O 44 , O 26 , O 56 , O 86 , O 111 , O 125 , O 126 , O 127 , O 157 … Dựa vào hội chứng bệnh và tính chất gây bệnh của E. coli người ta chia thành 5 nhóm: EaggEC (enteroaggregative E. coli = E. coli kết tập ở ruột), EHEC (enterohemorrhagic E. coli = E. coli gây xuất huyết ở ruột), EIEC (enteroinvasive = E. Coli xâm lấn niêm mạc ruột), EPEC (entero- pathogenic E. coli = E. coli gây bệnh đường ruột) và ETEC (enterotoxogenic E. coli = E. coli sinh độc tố ruột). Thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ tùy theo dòng vi khuẩn và loại độc tố. Loại độc tố ruột có thời gian gây bệnh trung bình 26 giờ, biến thiên từ 4 – 44 giờ. Loại độc tố tế bào (cytotoxin) có thời gian gây bệnh trung bình 11giờ, biến thiên từ 8 – 24giờ. Bệnh phát ra đột ngột, đau bụng dữ dội rất ít nôn mửa, đi phân lỏng khoảng 1 – 15 lần/ngày. Nhiệt độ cơ thể bình thường hoặc tăng nhẹ, bệnh kéo dài 1 – 3 ngày rồi khỏi. Trường hợp nặng thì có thể sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, thời gian khỏi bệnh tương đối dài [10]. Ngộ độc do vi khuẩn Shigella. Ngộ độc do Shigella được ghi nhận tại Mỹ, nhưng hầu hết là do nguồn nước bị nhiễm S. sonnei, S. flexnen, S. disentenae và S. boydii. Nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn phát triển là 37 0 C, biến thiên từ 10 – 40 0 C. Chúng chịu được nồng độ muối 5 – 6%. Vi khuẩn gây bệnh bằng nội độc tố loại - 9 - liposaccharide tác động trực tiếp trên niêm mạc ruột. Thời gian ủ bệnh từ 1 – 7 ngày, trung bình dưới 4 ngày. Triệu trứng thay đổi từ nặng đến nhẹ như: đau thắt bụng, ớn lạnh, tiêu chảy có máu lẫn màng niêm mạc mủ, đau đầu, ói mửa. Ngoài ra còn nhiều loại vi khuẩn, virus gây ngộ độc thực phẩm. Trong đó đáng chú ý là vi khuẩn yếm khí C. perfrigens đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu và xác định là một trong những tác nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm [10]. 4. Những hiểu biết về vi khuẩn C. perfringens Lần đầu tiên Feser (1865) phát hiện C. perfringens, sau đó các tác giả lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra. Loài C. perfringens lần đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892) trong tổ chức có hơi của xác người chết và được đặt tên là Bacillus aerogens capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus perfringens do Veillon và Zuber (1898) và thành Bacillus welchii [13] 4.1. Đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu C. perfrigens là trực khuẩn có khả năng sinh nha bào, nha bào hơi lệch tâm, vi khuẩn không có khả năng di động chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Là trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm gram dương đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song. Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4)  (1,3 - 19) m [13], [14]. Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C. perfringens - 10 - 4.2. Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường. Trên môi trường thạch máu: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37 o C, vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc tròn ướt có hai vòng dung huyết xung quanh [14]. Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen, do vi khuẩn sinh H 2 S tác dụng với Fe (trong môi trường) tạo thành FeS có màu đen [20]. Trên môi trường nước thịt gan yếm khí vi khuẩn mọc rất tốt, nhanh chóng làm đục môi trường. 4.3. Đặc tính sinh vật, hóa học Môi trường Egg yorlk, vi khuẩn phát triển sinh men lecithinane phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc. Trên môi trường Litmus milk: vi khuẩn lên men đường lactose, làm đông vón casein. Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH Litmus. Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose, maltose, sucrose. Không lên men manitol, không sinh indol [20]. 4.4. Phân loại. Dựa vào khả năng sinh độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota), người ta chia C. perfrigens thành 5 type độc tố khác nhau bao gồm các type: A, B, C, D, E. Ngoài ra vi khuẩn còn sản sinh một số các độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin. Trong những năm gần đây một số tác giả còn phát hiện độc tố beta 2 [11]. [...]... phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C perfringens không quá 10 vi khuẩn/ gam [2] - 15 - CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Nội Dung Phân lập vi khuẩn C perfrigens trên thịt gà ở một số chợ trong TP Nha Trang Định lượng vi khuẩn C perfringens có trong 1 gam thịt gà Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn phân lập được Xác định type độc tố vi khuẩn bằng kỹ thuật Multiplex. .. nhiệt độ - 800C 4.8 Phương pháp định type độc tố vi khuẩn C perfringens bằng kỹ thuật Multiplex – PCR Để xác định type vi khuẩn, chúng tôi dựa vào vi c xác định gen mã hoá các độc tố chính của các vi khuẩn phân lập được bằng vi c sử dụng phản ứng Multiplex – PCR Từ đó kết luận type vi khuẩn phân lập được Ở đây chúng tôi sử dụng cặp mồi cho phản ứng Multiplex – PCR do Bộ môn nghiên cứu Vi trùng Phân Vi n... thì mỗi type độc tố có khả năng sản sinh các loại độc tố khác nhau: type A chỉ sản sinh độc tố chính alpha; type B sản sinh 3 loại độc tố chính là alpha, beta và epsilon; type C sản sinh 2 loại độc tố chính là alpha và beta; type D sản sinh 2 loại độc tố chính là alpha và epsilon; type E sản sinh hai loại độc tố chính là alpha và iota Ngoài ra type A và type C còn có khả năng sản sinh độc tố ruột enterotoxin... dụng quy trình phân lập vi khuẩn C perfringens theo quy trình phân lập của Bộ môn nghiên cứu Vi trùng Phân vi n Thú y miền Trung - 17 - Sơ đồ phân lập Mẫu Fluid Thyoglycolate Môi trường đặc hiệu (TSC agar) Chọn khuẩn lạc tăng sinh trên môi trường thạch máu Xác định các đặc tính sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn Định type vi khuẩn 4.3 Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn có trong 1gam thịt gà Chúng tôi... C perfringens trên môi trường thạch máu 5.2 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hoá học Sau khi phân lập chúng tôi tiến hành kiểm tra một số đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn C perfringens phân lập được bằng phản ứng lên men một số loại đường và tạo hợp chất trung gian, trên các môi trường đặc hiệu Kết quả kiểm tra được thể hiện ở bảng 3.3 - 32 - Bảng 3.3 Kết quả giám định một số đặc tính. .. độc tố chính của vi khuẩn bằng phản ứng Multiplex PCR Từ kích thước sản phẩm thu được, xác định type độc đố Dựa vào khả năng sản sinh type độc tố chính của vi khuẩn mà kết luận được chủng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập được thuộc type vi khuẩn nào Kết quả đinh type độc tố được trình bày ở hình 3.10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P N M 1000 bp 500 bp 402 bp Hình 3.10 Kết quả xác định gen mã hoá độc tố vi khuẩn C perfringens. .. 24 mẫu thịt gà lấy ở 4 chợ trên, chúng tôi tiến hành phân lập và giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học để xác định sự có mặt của C perfringens Tỷ lệ dương tính được tính theo công thức: (%) = Trong đó: A * 100 B A: số mẫu dương tính B: số mẫu kiểm tra Kết quả phân lập được thể hiện ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm C perfringens trên thịt gà ở 4 chợ tại Nha Trang Tỷ lệ dương tính Địa điểm Số mẫu... màu đen Số lượng vi khuẩn có trong 1 gam thịt gà được tính bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường TSC, cấy kiểm tra trên môi trường thạch máu Sau đó kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học Trên cơ sở những đặc tính sinh vật, hóa học đã được kiểm tra tiến hành định danh vi khuẩn - Số lượng vi khuẩn có... perfringens từ các mẫu gà bị bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả những vi khuẩn phân lập được đều là C perfringens, có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết Soi trên kính hiển vi điện tử chúng là các trực khuẩn Gram dương và không di động Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc. .. tế bào của - 11 - động vật Eukaryotic, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận Độc tố epsilon được tiết ra như là 1 tiền độc tố và được kích hoạt bằng men proteolytic Iota toxin có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia) Sau khi độc tố gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào Enterotoxin: là độc tố được . tài: “PHÂN LẬP, GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC VÀ ĐỊNH TYPE ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN YẾM KHÍ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN THỊT GÀ TẠI MỘT SỐ CHỢ TRONG ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ NHA TRANG BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX. Phân lập vi khuẩn C. perfrigens trên thịt gà ở một số chợ trong TP Nha Trang.  Định lượng vi khuẩn C. perfringens có trong 1 gam thịt gà.  Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi. [4]. 2.4. Ngộ độc do vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật Thông thường các vi sinh vật khi nhiễm vào thực phẩm chúng tiết độc tố gây ngộ độc cho người sử dụng. Độc tố của vi sinh vật có thể có bản