TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VIRUT ĐẬU TRÊN ĐÀN DÊ, CỪU NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐẬU DÊ, CỪU Giáo viên hướng dẫn: TS. VŨ NGỌC BỘI Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ THU TRANG Lớp: 47 CNSH NHA TRANG, 2009 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, trước tiên em xin gửi tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng Đào tạo Đại học và Sau Đại học lòng biết ơn, niềm tự hào được học tập tại trường trong nhiều năm qua. Lòng biết ơn chân thành xin được giành cho thầy TS. Vũ Ngọc Bội – phó giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Ths Đỗ Văn Khiên – phó trưởng bộ môn Nghiên cứu Siêu vi trùng Phân viện Thú y Miền Trung đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án này. Xin chân thành cảm ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa – giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Ths. Khúc Thị An – quyền trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học, TS. Nguyễn Đức Tân – Viện trưởng Phân viện Thú y miền Trung, các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học, các cán bộ Phân viện đã giảng dạy, tạo điều kiện cho em trong thời gian qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm đồ án. Nha Trang, ngày 18 tháng 07 năm 2009 Sinh viên Tr ần Thị Thu Trang Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ivi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1 1.1. Giới thiệu về phân viện Thú y miền Trung 1 1.2. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới và ở Việt Nam 1 1.2.1. Trên thế giới 2 1.2.2 Tình hình chăn nuôi dê ở Việt Nam 3 1.3. Bệnh đậu dê 4 1.3.1. Giới thiệu về bệnh 4 1.3.2. Tình hình dịch bệnh đậu dê trên thế giới và tại Việt Nam 5 1.3.3. Đặc điểm chung về bệnh 11 1.4. Miễn dịch chống virus 16 1.4.1. Miễn dịch không đặc hiệu 16 1.4.2. Miễn dịch đặc hiệu 16 1.5. Một số phương pháp chẩn đoán bệnh đậu dê 19 1.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 19 1.5.2. Bệnh tích mổ khám 19 1.5.3. Chẩn đoán thí nghiệm 20 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2. Nguyên liệu 24 2.3. Dụng cụ và hoá chất 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ 25 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu 25 2.4.3. Phương pháp xử lý mẫu 26 2.4.4. Phản ứng PCR 28 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m iii 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. Kết quả điều tra bệnh đậu dê tại địa phương nghiên cứu 35 3.1.1. Tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo tổng đàn điều tra 35 3.1.2. Kết quả điều tra tỷ lệ dê nghi mắc bệnh đậu theo mùa vụ 36 3.1.3. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu theo nhóm tuổi 38 3.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm virus đậu dê trong các mẫu bệnh phẩm kiểm tra bằng phương pháp PCR 40 3.2.1. Tỷ lệ nhiễm virus đậu dê theo khu vực chăn nuôi 40 3.2.2. Tỷ lệ nhiễm virus đậu theo nhóm tuổi của dê, cừu 42 3.2.3. Kết quả xác định tỷ lệ dương tính với virus đậu dê theo đối tượng gia súc 43 3.4. Kết quả xác định gen kháng nguyên (P32) quy định yếu tố độc lực của virus đậu dê để phục vụ cho việc nghiên cứu gen cấu trúc kháng nguyên và miễn dịch học.44 3.5. Quy trình chẩn đoán quả bệnh đậu dê, cừu 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 47 4.1. Kết luận. 47 4.2. Đề xuất ý kiến 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Bảng phân bố tình hình bệnh đậu dê trên thế giới 6 Bảng 2.1. Thành phần Master Mix cho một mẫu phản ứng PCR 32 Bảng 3.1. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu theo mùa vụ 37 Bảng 3.2. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu theo nhóm tuổi.Error! Bookmark not defined. Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm virus đậu theo nhóm tuổi của dê, cừu 42 Bảng 3.5. Tỷ lệ dương tính với virus đậu dê theo đối tượng gia súc 43 Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu chứa đoạn gen P32 trong các mẫu kiểm tra 44 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo của virus đậu dê 14 Hình 2.1. Quy trình tách chiết DNA từ vảy mụn đậu. 27 Hình 2.2. Các bước thực hiện phản ứng PCR 30 Hình 3.1. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu theo tổng đàn điều tra 35 Hình 3.2. Sản phẩm chạy PCR 40 Hình 3.3. Sản phẩm chạy PCR của đoạn gen P32 44 Hình 3.4. Quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu 45 Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AE : Elution Buffer AGID : Agar Gel Immuno Diffusion test ATL : Tissue Lysis Buffer AVL : Viral Lysis Buff er AW1 : Wash Buffer ( 1 ) AW2 : Wash Buff er ( 2 ) Bp : Base pair DNA : Desoxyribo Nucleic Acid EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic acid Kb : Kilobase PBS : Phosphate Buffer Saline PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris aminimethane Acetic acid EDTA TBE : Tris aminimethane Boric acid EDTA Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m 1 LỜI MỞ ĐẦU Chăn nuôi có vai trò quan trọng trong cung cấp thực phẩm, thịt, sữa và sức kéo cho con người đặc biệt là ở những nước đang phát triển như nước ta. Trong những năm đầu thế kỷ 21, việc đẩy mạnh phát triển về số lượng gia súc đang được nhiều quốc gia quan tâm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người. Chỉ tiêu phấn đấu của ngành chăn nuôi giai đoạn 2005 – 2010 là đạt tỷ trọng trên 30% GDP nông nghiệp. Theo số liệu thống kê hàng năm, sự tăng trưởng bình quân của đàn trâu bò là 2,8% / năm. Chăn nuôi dê cần ít vốn, quay vòng vốn nhanh, tận dụng được lao động và điều kiện tự nhiên ở nhiều vùng sinh thái. Đây là hướng hợp lý cho phát triển chăn nuôi của nông dân nghèo. Khuyến khích chăn nuôi gia súc nhai lại nhỏ như dê là cuộc cách mạng thích hợp để giải quyết các vấn đề đói nghèo cho nhân dân các tỉnh trung du và miền núi hơn các chương trình phát triển các gia súc lớn. Chăn nuôi gia súc lớn cần đầu tư vượt quá khả năng của đa số nông dân, thời gian thu hồi vốn lâu hơn và tiềm ẩn nhiều nguy cơ về kinh tế. Chăn nuôi dê góp phần đa dạng hóa sản phẩm nông nghiệp, ổn định kinh tế và xã hội, giảm đói nghèo, tăng tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp. Trong những năm qua, nhờ chính sách mở cửa của nhà nước, cùng với gia tăng nhu cầu sử dụng nguồn thực phẩm của xã hội đã thúc đẩy ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi dê nói riêng phát triển mạnh mẽ. Hình thành nhiều mô hình chăn nuôi theo kiểu trang trại với quy mô từ hàng chục, hàng trăm đến hàng nghìn con. Nhiều hộ gia đình áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào chăn nuôi như lai tạo con giống, cải tiến chuồng trại, cải tiến quy trình chăn thả chế biến thức ăn… Vì vậy đã góp phần tăng năng suất, chất lượng và hiệu quả chăn nuôi, giúp người chăn nuôi xóa đói, giảm nghèo và từng bước làm ăn có lãi, góp phần vào sự tăng trưởng kinh tế của đất nước. Tuy nhiên, các bệnh truyền nhiễm là một nguyên nhân quan trọng có thể gây cản trở mục tiêu trên. Do đặc thù khí hậu khu vực duyên hải miền Trung là khô hạn kéo dài, một năm có 2 mùa: mùa mưa và mùa khô. Nắng nóng, mưa nhiều tạo điều kiện thuận lợi cho dịch bệnh xảy ra trên đàn gia súc. Ngoài các bệnh thường gặp như lở mồm long móng,viêm loét miệng truyền nhiễm,bệnh về đường hô hấp và tiêu hoá…hiện nay còn xuất hiện bệnh đậu dê làm giảm khả năng Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m 2 sinh sản và chất lượng của thịt, lông, da từ đó gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các hộ nông dân nhất là các hộ nông dân nghèo. Bệnh đậu dê là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho dê và được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A – bảng các bệnh truyền nhiễm cực kì nguy hiểm. Bệnh xuất hiện trên thế giới từ khoảng năm 200 sau Công nguyên nhưng đến năm 1879, Hansen ở Nauy thông báo phát hiện bệnh đậu dê. Ở Việt Nam, bệnh mới chỉ xuất hiện từ đâu năm 2005, năm 2006 – 2007 bệnh bùng phát thành dịch ở nhiều địa phương, đã gây nhiều thiệt hại về kinh tế đặc biệt đối với các hộ chăn nuôi nghèo và ảnh hưởng đến các hoạt động xã hội khác. Bệnh đậu dê do virus đậu dê (Goat pox virus) thuộc nhóm Capripoxvirus họ Poxviridae gây nên, bệnh lây lan rất nhanh, có thể xảy ra ở dê mọi lứa tuổi, mọi giống, trên cả con đực và con cái. Bệnh đậu dê là bệnh quan trọng nhất trong số các loại bệnh đậu của loài nhai lại, gây tỉ lệ chết cao trong dê con. Xuất phát từ tình hình thực tế, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu: “Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus đậu trên đàn dê, cừu nuôi tại một số tỉnh miền Trung và xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu”. Nội dung của đồ án như sau: 1. Xác định một số đặc điểm dịch tễ của bệnh đậu dê tại một số tỉnh miền Trung. 2. Xác định tỷ lệ nhiễm virus trong các mẫu bệnh phẩm thu thập, 3. Xác định sự có mặt của gen P32 quyết định độc lực và tính kháng nguyên của virus đậu dê 4. Xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê. Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về phân viện Thú y miền Trung Phân viện trưởng phân viện Thú y miền Trung: TS. Nguyễn Đức Tân. Phân viện Thú y miền Trung được thành lập theo quyết định số 213 NN/TC QĐ ngày 23 tháng 7 năm 1977 của Bộ Nông nghiệp (nay là Bộ Nông Nghiệp và PTNT). Phân viện Thú y miền Trung hoạt động theo cơ chế 115 từ ngày 27/06/2007 theo quyết định số 178/QĐ – BNN – TCCB của Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn. Giấy chứng nhận đăng kí hoạt động KHCN số 05/2007/SKHCN ngày 4/12/2007. Chức năng và nhiệm vụ: - Nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ Thú y. - Sản xuất các loại Vaccine và sinh phẩm Thú y. - Đào tạo, bồi dưỡng nghiệp vụ Thú y. - Chẩn đoán bệnh động vật. Lực lượng cán bộ khoa học: Biên chế bộ máy nghiên cứu khoa học của Phân Viện là 43 cán bộ, viên chức trong đó có 5 tiến sỹ, 8 thạc sỹ, 22 đại học, 8 nhân viên kỹ thuật. Danh hiệu mà Phân viện đã đạt được trong hơn 30 năm qua: - Huân chương lao động hạng ba (1983) - Huân chương lao động hạng hai (1987). - Huân chương lao động hạng nhất (2003) . 1.2. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới và ở Việt Nam Dê là gia súc nhai lại nhỏ thuộc loài dê (Capra), họ phụ dê cừu (Caprarovanae), họ sừng rồng (Bovidae), bộ phụ nhai lại (Ruminantia), bộ guốc chẵn (Artiodactyta), lớp có vú (Manmalian). Dê rừng (Capra aegagrus) trên thế giới được chia làm ba nhóm: Nhóm 1 là: Bezoar (C.aegagrus), nhóm này có sừng hình xoắn. Nhóm 2 là: Ibex (C.Ibex) và Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m Click to buy NOW! P D F - X C h a n g e V i e w e r w w w . d o c u - t r a c k . c o m [...]... Capripoxvirus, ngoài virus gây bệnh đậu dê còn có virus gây bệnh đậu cừu, virus gây bệnh da nổi cục ở bò và một số virus gây bệnh đậu khác Tuy nhiên chỉ có bệnh đậu dê và đậu cừu là có thể lây chéo cho 2 loài dê và cừu còn virus gây bệnh da nổi cục ở bò không lây sang dê, cừu trong điều kiện tự nhiên [20] Dê các lứa tuổi đều mắc bệnh nhưng bệnh nặng nhất đối với dê con Bệnh đậu lây lan rất nhanh, dê trưởng... virus đậu dê Virus đậu dê là DNA virus hai sợi có vỏ bọc, thuộc nhóm Capripoxvirus, họ Poxviridae [36] Trong nhóm Capripoxvirus, ngoài virus gây bệnh đậu dê còn có virus gây bệnh đậu cừu và virus gây bệnh u da ở bò Tuy nhiên, trong điều kiện tự nhiên chỉ có virus đậu dê và virus đậu cừu là có thể gây nhiễm chéo cho hai loài dê và cừu, còn virus gây bệnh u da ở bò không lây sang dê, cừu Khi giải trình. .. vuốt, và hầu hết các chủng virus có khuynh hướng chỉ gây bệnh lâm sàng cho một loài Trong điều kiện tự nhiên, bệnh đậu dê chỉ gây nhiễm cho dê, nhưng vật chủ lại khác nhau qua các lần phân lập Kết quả phân lập tại Kenya, Yemen cũng như Oman cho thấy tỷ lệ nhiễm trên dê và cừu là tương đương [12], [13] Kết quả phân lập từ Trung Đông và Ấn Độ cho thấy virus chỉ gây nhiễm cho dê mà không gây nhiễm cho cừu. .. vững ở gia đình đặc biệt là vùng Trung du đồi núi dân nghèo nước ta [1] 1.3 Bệnh đậu dê 1.3.1 Giới thiệu về bệnh đậu dê Bệnh đậu dê là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, được Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A - bảng các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Pháp lệnh thú y Việt Nam xếp bệnh vào danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phải công bố dịch Bệnh do chủng virus đậu dê thuộc giống Capripoxvirus,... e Vi e N y c - Bệnh tích ở phổi: tổn thương đậu nghiêm trọng và lan rộng, phân bố tập trung và đồng dạng khắp lá phổi 1.5.3 Chẩn đoán thí nghiệm * Các bệnh phẩm dùng để chẩn đoán Để chẩn đoán và giám định virus, bệnh phẩm có thể là huyết thanh, máu con vật đang thời kỳ nung bệnh, dịch mụn đậu, vảy mụn đậu Nên lấy mẫu trong tuần đầu tiên khi triệu chứng lâm sàng xuất hiện và bảo quản bệnh phẩm ở nhiệt... nên các mụn nổi có mủ, có dạng như hạt đậu trên da, niêm mạc của động vật mắc bệnh [8] Bệnh thường phát sinh vào đầu mùa xuân, đầu mùa mưa khi thời tiết bắt đầu ấm áp và ẩm ướt [23] 1.3.2 Tình hình dịch bệnh đậu dê trên thế giới và tại Việt Nam * Trên thế giới Bệnh đậu dê thường lưu hành ở khu vực Đông Nam Á, tiểu lục địa Ấn Độ, khu vực Bắc và Trung châu Phi Bệnh thường hay xuất hiện ở những khu vực... hợp dê mắc bệnh có triệu chứng như bệnh đậu dê ngày nay Đến năm 1879, Hansen ở Nauy đã thông báo phát hiện ra bệnh đậu dê Sau đó bệnh được phát hiện tại Macedonia trong thế chiến thứ nhất và trở thành dịch địa phương năm 1926 với tỷ lệ chết 15% Bệnh đã gây thiệt hại đáng kể, làm giảm khả năng sinh sản và chất lượng của thịt, sữa, lông và da Nó thách thức lớn cho ngành chăn nuôi dê, cừu và cũng tác... dịch bệnh đã xuất hiện tại huyện Trùng Khánh, tỉnh Cao Bằng đe dọa 1.000 con dê của các hộ chăn nuôi với số lượng dê mắc bệnh là 598 con và số chết là 515 con Sau đó bệnh xảy ra trên dê của huyện Lục Ngạn tỉnh Bắc Giang ngày 13/1/1005, tại huyện Hữu Lũng tỉnh Lạng Sơn ngày 25/1/2005 và huyện Mỹ Đức tỉnh Hà Tây ngày 18/3/2005 (số liệu do cục Thú y gửi OIE ngày 2/5/2005) Theo két quả xét nghiệm của Trung. .. có số liệu Fernandez, 1991 Jordan Đang tồn tại Không có số liệu Abo- Shehada, 1990 Kirgizia Đang tồn tại Không có số liệu OIE, 1996 Kuwait Đang tồn tại Không có số liệu Fernandez., 1991 Lebannon Đang tồn tại Không có số liệu OIE, 1993 Sri Lanka Đang tồn tại Không có số liệu OIE, 1996 Myanmar Đang tồn tại Không có số liệu OIE, 1990 Mongolia Đang tồn tại Không có số liệu OIE, 1999 Nepal Đang tồn tại. .. biệt, người ta đã phát hiện thấy có một số chủng virus đậu dê có khả năng gây bệnh cho người, tuần lộc Bệnh đậu dê có thể xảy ra ở dê mọi lứa tuổi, mọi giống, trên cả con đực và con cái nhưng thường xảy ra nghiêm trọng trên dê non, dê cái cho sữa và dê già Các giống châu Âu cảm nhiễm nhất Tỷ lệ chết cao đặc biệt khi bị nhiễm kết hợp với các bệnh khác như các dịch bệnh của tiểu gia súc nhai lại, hoặc . SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VIRUT ĐẬU TRÊN ĐÀN DÊ, CỪU NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐẬU DÊ, CỪU . Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus đậu trên đàn dê, cừu nuôi tại một số tỉnh miền Trung và xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu . Nội dung của đồ án như sau: 1. Xác định một số đặc điểm. gây bệnh đậu dê còn có virus gây bệnh đậu cừu, virus gây bệnh da nổi cục ở bò và một số virus gây bệnh đậu khác. Tuy nhiên chỉ có bệnh đậu dê và đậu cừu là có thể lây chéo cho 2 loài dê và cừu