LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, con xin gởi đến ba mẹ, người đã nuôi con khôn lớn, là nguồn động viên, là chỗ dựa tinh thần vững chắc, luôn tạo mọi điều kiện cho con ăn học nên người. Em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thu Thủy, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh Nguyễn Trọng Hiếu, anh Nguyễn Văn Hưng và anh Nguyễn Duy Khánh, đã rất tận tình hướng dẫn em thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm qua. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và tất cả các anh chị trong công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt đồ án này. Em cảm ơn chị Ngô Huỳnh Phương Thảo, trưởng phòng CNSH Thủy Sản – Trung tâm CNSH TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em rất nhiều trong công tác tìm mẫu làm thực nghiệm. Và cuối cùng, gởi lời cảm ơn đến tập thể 48 CNSH, các bạn trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Mở và Đai học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, những người bạn đã luôn động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập ở trường và trong thời gian thực tập vừa qua. Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2010 Sinh viên thực hiện Võ Thị Lƣu i MỤC LỤC Danh mục các từ viết tắt iii Danh mục bảng iv Danh mục hình v Đặt vấn đề 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Ở Việt Nam 5 1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV) 6 1.2.1. Hình thái cấu trúc 6 1.2.2. Cách thức lan truyền 9 1.2.3. Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV 10 1.2.4. Sự nhạy cảm của các loài tôm với IHHNV 11 1.2.5. Mô mục tiêu 12 1.3. Các phƣơng pháp phát hiện IHHNV trên tôm 12 1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 12 1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ 13 1.3.3. Phương pháp kháng thể đơn dòng 13 1.3.4. Kỹ thuật sinh học phân tử 14 1.3.4.1. Kỹ thuật PCR 14 1.3.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR 15 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 16 2.1.1. Mẫu thí nghiệm 16 2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR 16 2.1.3. Hóa chất 17 ii 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 17 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Thu mẫu 18 2.2.2. Tách chiết DNA 18 2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 19 2.2.4. Điện di gel agarose 22 2.2.5. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA 26 3.2. Xây dựng quy trình PCR chẩn đoán bệnh IHHNV 26 3.2.1. Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của cặp mồi trên lý thuyết 26 3.2.2.1. Thiết kế mồi 26 3.2.2.2. Các thông số của mồi 26 3.2.2.3. Tính đặc hiệu của mồi 30 3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR 34 3.2.2.1. Sự hoạt động của mồi trên thực tế. 34 3.2.2.2. Nhiệt độ lai 36 3.2.2.3. Độ đặc hiệu của mồi 37 3.2.2.4. Độ nhạy của quy trình 39 3.3. Ứng dụng quy trình để chẩn đoán bệnh IHHNV trên tôm 40 Kết luận và kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl : Microliter µM : MicroMol A : Adenosine BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : Base pair C : Cytidine dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate dTTP : Deoxythymidine triphosphate EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid G : Guanosine ha : Hecta IHHNV : Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ) kDa : kilodalton mM : MilliMol nm : Nanometer PCR : Polymerase Chain Reaction SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophosis T : Thymidine TAE : Tris - Acetic acid - EDTA TE : Tris - EDTA T m : Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy) iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Loài tôm nhạy cảm với IHHNV 11 Bảng 2: Các thông số của cặp mồi IHHNV 318F/R 16 Bảng 3: Cách pha mix PCR 21 Bảng 4: Các cặp mồi tham khảo để thiết kế cặp mồi IHHNV 318F/R 27 Bảng 5: Một số đặc tính của cặp mồi IHHNV 318F/R 27 v DANH MỤC HÌNH Hình 1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới 4 Hình 2: Cấu trúc của IHHNV 6 Hình 3: Cấu trúc bộ gen IHHNV hoàn chỉnh 8 Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV 10 Hình 5: Thể vùi Cowdry Type A được tìm thấy trên tế bào tôm nhiễm IHHNV . 12 Hình 6: Nguyên tắc của phản ứng PCR 14 Hình 7: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 28 Hình 8: Một số cấu trúc sefl - dimer của mồi 29 Hình 9: Một số cấu trúc hetero - dimer của mồi 30 Hình 10: Kết quả BLAST trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên NCBI 31 Hình 11: Kết quả sắp gióng mồi xuôi và mồi ngược với các trình tự tải về từ GeneBank bằng phần mềm BioEdit 32 Hình 12: Kết quả kiểm tra mồi xuôi và mồi ngược bằng phần mềm Anhyb 34 Hình 13: Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của cặp mồi 35 Hình 14: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi IHHNV 318F/R 36 Hình 15: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi IHHNV 318F/R 38 Hình 16: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 39 Hình 17: Kết quả ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh IHHNV 40 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới. Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ, dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Trong khi bệnh đốm trắng do WSSV (White Spot Syndrome Virus) gây nguy hiểm ở tôm sú (Penaeus monodon) thì bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ do IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) gây ra là tác nhân nguy hiểm nhất ở tôm Penaeus stylirostris (còn gọi là Litopenaeus stylirostris) và tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei (hay Litppenaueus vannamei). Tuy virus này không gây chết cho tôm sú (P. monodon) nhưng lại là một trong những tác nhân gây hội chứng chậm lớn và dị hình (Runt Deformity Syndrome - RDS), đặc biệt nguy hiểm cho tôm thẻ chân trắng P. vannamei và gây chết hàng loạt ở tôm P. stylirostris. Việc gia tăng hội chứng RDS trong các trang trại nuôi tôm đã buộc các nhà nghiên cứu phát triển nguồn tôm P. vannamei sạch bệnh không bị nhiễm IHHNV. Trên thế giới, sự lây nhiễm IHHNV trên tôm có thể được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp mô bệnh học, phương pháp lai tại chỗ, hay bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR và Real-time PCR… Tại Việt Nam, bộ Kit Real-time PCR nhằm phát hiện IHHNV đã được thương mại hóa bởi Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, giá thành và các yêu cầu về trang thiết bị phòng thí nghiệm cũng như kỹ thuật của người làm xét nghiệm đòi hỏi rất cao, do vậy phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi cho các trung tâm kiểm dịch dịch bệnh thủy sản ở các tỉnh thành trong cả nước. Vì vậy, việc xây dựng quy trình PCR phát hiện bệnh IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam là điều cần thiết, nhằm phát hiện và xử lý kịp thời bệnh do IHHNV gây ra. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm”. 2 Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây: - Xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện IHHNV trên tôm có độ nhạy cao, chi hợp lý. - Khảo sát khả năng ứng dụng quy trình trên các mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh 1.1.1. Trên thế giới Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số nước trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam. Trong các đối tượng thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất. Theo công bố của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO – Food and Agriculture Organization), sản lượng tôm thế giới trong 2 thập kỷ qua (1980 - 1998) tăng 175 %. Theo báo cáo của hội nghị nuôi tôm toàn cầu (2003), sản lượng tôm nuôi trên thế giới từ năm 1999 như sau: 1,084 triệu tấn (1999), 1,143 triệu tấn (2000), 1,291 triệu tấn (2001), 1,445 triệu tấn (2002), và 1,84 triệu tấn (2003). Mức tăng bình quân khoảng 10,5 % mỗi năm [1] . Năm 2000, xuất khẩu tôm thế giới đạt hơn 10,9 tỷ USD. Với hiệu quả kinh tế và xã hội to lớn, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút các nhà đầu tư. Sự phát triển mạnh mẽ, có thể nói là bùng nổ nghề nuôi tôm trên thế giới ngoài những mặt lợi còn có mặt trái của nó. Trong suốt 2 thập kỷ qua, nghề nuôi tôm trên thế giới đã có rất nhiều thay đổi và trải qua nhiều khó khăn. Dịch bệnh đã liên tiếp xuất hiện ở nhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là các nước châu Á, trong đó bệnh do virus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền công nghiệp nuôi tôm. Ước tính tổng thiệt hại do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD [2, 3] . Bệnh hoại tử máu và vỏ do IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus) là một trong những bệnh virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm. Virus này khi thâm nhập vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Nuôi tôm ở giai đoạn postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm nhiễm virus có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi trên mặt nước, xoay tròn và chết. Tỷ lệ tôm 4 chết khi nhiễm bệnh khá cao: tôm P. vannamei 10-50%, tôm tự nhiên (Ecuado) 63%, tôm nuôi (Panama) 95% [9, 10] . IHHNV được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1981 ở Hawaii khi gây chết hàng loạt tôm P. stylirostris [10, 16, 17] . Sau đó virus lan rộng đi khắp nơi như Tahiti, Florida, Texas, Islands, Israel, Panama, Costa Rica, Belize, Ecuador, Brazil, Honduras, France và Jamaica [23] và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi trồng thủy sản ở các nước trên. Theo các báo cáo khoa học của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE – Office International des Epizooties), IHHNV xuất hiện khắp nơi trên thế giới hoặc trong môi trường hoang dã hoặc trong tôm Penaeid nuôi. Ở Tây bán cầu, IHHNV thường được tìm thấy ở tôm Penaeid hoang dã ở Đông Thái Bình Dương từ Peru đến Mexico (Hình 1). Hình1: Bản đồ minh họa sự xuất hiện của virus IHHNV trên thế giới Những năm gần đây, bệnh do IHHNV xuất hiện ở các nước Trung Mỹ như: Belize, Brazil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, E1 Salvador, Honduras, Mexico, New [...]... 3] Theo khảo sát của các nhà khoa học, bên cạnh WSSV, MBV và YHV, IHHNV là một trong những virus gây bệnh phổ biến có mặt tại nhiều vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước[4, 5] 6 1.2 Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV) 1.2.1 Hình thái và cấu trúc IHHNV là một trong những virus gây bệnh ở tôm Penaeid có kích thước nhỏ nhất Virus này có hình khối 20 mặt (Hình 2), đường kính khoảng... gắn chất phát huỳnh quang (FAM, TAMRA, …) Các phẩm nhuộm như SYBR Green, Hoechst khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang Mix PCR có chứa phẩm nhuộm phát huỳnh quang, khi gắn vào mạch đôi DNA sẽ thể hiện cường độ màu tương ứng với nồng độ ban đầu của DNA bản mẫu Đối với tôm, kỹ thuật Real-time PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh do virus gây ra như bệnh đỏ đuôi (Taura), bệnh hoại tử (IHHNV) ... xoay tròn và chìm xuống đáy Tôm non giảm tăng trưởng và phát triển bất thường Tôm giai đoạn tiền trưởng thành có hiện tượng biến dạng chủy[4, 9] Ở tôm sú có hiện tượng tôm ngả màu xanh, dấu hiệu biến dạng chủy ở tôm sú xảy ra chậm so với tôm thẻ chân trắng, quan sát được ở những tôm có kích thước lớn, xuất hiện đốm trắng hoặc vàng trên vỏ kitin, đặc biệt là ở các phiến vỏ nối giữa lưng và bụng, tôm sắp... giới, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng rộng rãi để phát hiện nhiều bệnh do vi khuẩn và virus gây ra trên tôm trong đó có bệnh do IHHNV gây ra [17, 22] Kỹ thuật này được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh chóng và cho kết quả chính xác trong chẩn đoán IHHNV 15 1.3.4.2 Kỹ thuật Real-time PCR Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA diễn ra theo từng chu kỳ và được theo dõi... Xuất hiện bệnh trong tự nhiên Penaeus monodon Xuất hiện bệnh trong tự nhiên Penaeus semisulcatus Xuất hiện bệnh trong tự nhiên Litopenaeus setiferus Chứng minh bằng thực nghiệm Penaeus stylirostris Xuất hiện bệnh trong tự nhiên Penaeus vannamei Xuất hiện bệnh trong tự nhiên Bệnh do IHHNV thường xảy ra nghiêm trọng cho hầu hết tôm ở vùng Thái Bình Dương, virus có thể gây dịch cấp và có thể gây chết trên. .. (hay còn gọi là dưới vỏ) , mô liên kết, cơ quan tạo máu, cơ quan bạch huyết, tuyến râu, tuyến sinh dục và dây thần kinh bụng bao gồm nhánh và trung tâm thần kinh bụng[9, 10, 22] 1.3 Các phƣơng pháp phát hiện IHHNV trên tôm 1.3.1 Phƣơng pháp mô bệnh học Phân tích mô học cho thấy tế bào nhiễm IHHNV xuất hiện các thể nhân phồng lên, thể Cowdry type A (Hình 5) Khi nhuộm lát cắt với hematoxylin và eosin, IHHNV... virus Sự biểu hiện của chúng được điều hòa bởi hai promoter phiên mã độc lập[9] 1.2.3 Dấu hiệu tôm bị nhiễm IHHNV Các dấu hiệu tôm bệnh phát triển chậm và biến dạng vỏ do IHHNV thường xuất hiện ở giai đoạn hậu ấu trùng ở 35 ngày tuổi Trước giai đoạn này tôm có thể mang mầm bệnh nhưng không có biểu hiện ra bên ngoài[8, 21] 10 Một số biểu hiện bệnh có thể gặp bao gồm: giảm ăn, đôi khi tôm bơi chậm trên. .. nhợt và phần bụng có màu trắng đục, chủy bị biến dạng và phát triển lệch về một bên[4, 9] (Hình 4) Hình 4: Ảnh minh họa tôm bị nhiễm IHHNV Mũi tên chỉ các vị trí xuất hiện đốm trắng hoặc vàng trên tôm P stylirostris nhiễm bệnh Ngoài ra, IHHNV còn gây ra các triệu chứng cận lâm sàng như giảm tốc độ phát triển và làm giảm hiệu suất nuôi trên tôm sú, có thể giảm 10-50% so với mùa vụ tôm không nhiễm bệnh. .. bảo quản trong cồn trên 950, phải làm khô hết ethanol (cả trên bề mặt lẫn trong mô cơ của tôm) trước khi cho vào dung dịch TE 1X để nghiền - Đối với mẫu bảo quản trong tủ đông phải để rã đông trước khi tiến hành nghiền mẫu 19 - Lót lớp giấy thấm bên dưới, đặt mẫu tôm lên trên, dùng chày để cố định và panh kẹp để gắp những bộ phận là cơ quan đích, nơi khu trú của IHHNV (đối với mẫu tôm postlarvae thì... phương pháp đo quang phổ (OD) để xác định nồng độ DNA dựa vào độ hấp thụ tia UV ở bước sóng 260 nm Kết quả: Tỷ lệ: OD260/OD280 = 1,7 – 2.0 Như vậy, DNA được tách chiết theo quy trình trên đảm bảo độ tinh sạch, đủ điều kiện để chạy phản ứng PCR mà không làm ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng 3.2 Xây dựng quy trình PCR chẩn đoán bệnh IHHNV 3.2.1 Thiết kế mồi và kiểm tra các đặc tính của mồi trên lý thuyết . thời bệnh do IHHNV gây ra. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Xây dựng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (IHHNV) trên tôm . 2 Đề. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Ở Việt Nam 5 1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV) 6 1.2.1 MBV và YHV, IHHNV là một trong những virus gây bệnh phổ biến có mặt tại nhiều vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước [4, 5] . 6 1.2. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dƣới vỏ (IHHNV)