B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TR ẦN QUANG VUI LU ẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Ng êi Hà N ội - 2012 B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯ ỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TR ẦN QUANG VUI Chuyên ngành: Vi sinh v ật học thú y Mã s ố: 62 62 50 10 LU ẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Ngư ời hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. LÊ THANH HOÀ 2. TS. NGUYỄN BÁ HI ÊN Hà N ội - 2012 I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công tr ình nghiên c ứu của bản thân do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây. Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui II LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - PGS.TS. Lê Thanh Hòa và TS. Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đ ã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. - Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đ ã hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đ ã t ạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. - Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đ ã t ạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu. - Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án. - Th.S. Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đ ã t ận tình giúp đ ỡ, hỗ trợ về kỹ thuật trong quá trình nghiên cứu. Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu - đ ã đ ộng viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đ ình đ ể tôi dành thời gian cho nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nghiên cứu sinh Trần Quang Vui III MỤC LỤC Trang DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA . VI DANH M ỤC CÁC BẢNG VIII DANH M ỤC CÁC HÌNH XI M Ở ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: T ỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đ ại c ương về bệnh cúm gia cầm 4 1.1.1. L ịch sử bệnh cúm gia cầm 4 1.1.2. Tình hình d ịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới 5 1.1.3. Tình hình d ịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam 7 1.1.4. Nguyên nhân gây b ệnh 9 1.1.5. Cơ chế sinh bệnh 13 1.1.6. Tri ệu chứng lâm sàng 15 1.1.7. B ệnh tích 16 1.1.8. Chẩn đoán bệnh 18 1.1.9. Phòng ch ống bệnh cúm gia cầm 20 1.2. Sinh h ọc phân tử virus cúm A 24 1.2.1. H ệ gen của virus cúm A 24 1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng 26 1.2.3. Cơ ch ế phân tử quá tr ình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36 1.2.4. Các phương th ức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A 38 1.3. Ti ến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 42 1.3.1. S ự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 42 1.3.2. S ự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1 vào Vi ệt Nam 44 1.3.3. Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam 47 IV 1.4. Ph ản ứng RT -PCR trong nghiên c ứu virus cúm A 49 1.5. M ột số nghiên c ứu v ề sinh h ọc phân tử virus cúm A/H5N1 t ại Vi ệt Nam 50 1.6. T ầm quan tr ọng của việc giải m ã hệ gen virus cúm A/H5N1 54 CHƯƠNG 2: N ỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 56 2.1. Đ ối tượng nghiên cứu 56 2.2. Đ ịa điểm v à thời gian nghiên cứu 56 2.3. N ội dung nghiên cứu 56 2.3.1. Gi ải trình tự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4) phân l ập từ gà Hậu Giang 56 2.3.2. Phân tích so sánh thành ph ần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới 56 2.4. V ật liệu nghiên cứu 56 2.4.1. Nguyên li ệu 56 2.4.2. D ụng cụ và thiết bị 57 2.4.3. Hóa ch ất 57 2.4.4. Các dung d ịch và môi trường 57 2.5. Phương pháp nghiên cứu 58 2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số 58 2.5.2. Phương pháp RT-PCR 59 2.5.3. Phương pháp ki ểm tra sản phẩm RT -PCR 63 2.5.4. Phương pháp tinh s ạch sản phẩm RT -PCR 63 2.5.5. Phương pháp dòng hóa 64 2.5.6. Phương pháp gi ải tr ình tự 67 2.5.7. Phương pháp x ử lý số liệu 69 CHƯƠNG 3: K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 70 3.1. K ết quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5 N1 ch ủng CkHG4 70 3.1.1. K ết quả tách RNA tổng số 70 V 3.1.2. Kết quả giải trình tự các gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) 71 3.1.2.1. Gi ải trình tự gen H5 (HA) 71 3.1.2.2. Gi ải tr ình tự gen N1 (NA) 73 3.1.3. K ết quả giải trình tự cá c gen polymerase 75 3.1.3.1. Gi ải tr ình tự gen PB2 75 3.1.3.2. Gi ải trình tự gen PB1 76 3.1.3.3. Gi ải trình tự gen PA 77 3.1.4. K ết quả giải trình tự các gen NP, M và NS 79 3.1.4.1. Gi ải trình tự gen NP 79 3.1.4.2. Gi ải t rình t ự gen M 79 3.1.4.3. Gi ải trình tự gen NS 80 3.2. Phân tích so sánh thành ph ần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của ch ủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới 83 3.2.1. Phân tích gen H5 84 3.2.2. Phân tích gen N1 93 3.2.3. Phân tích gen PB2 102 3.2.4. Phân tích gen PB1 và PB1-F2 106 3.2.5. Phân tích gen PA 112 3.2.6. Phân tích gen NP 117 3.2.7. Phân tích gen M 120 3.2.8. Phân tích gen NS 124 3.3. Th ảo luận chung 131 K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 136 CÁC CÔNG TRÌNH Đ Ã CÔNG B Ố LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 138 TÀI LI ỆU THAM KHẢO 139 PH Ụ LỤC VI DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGH ĨA Ký hiệu Tiếng Anh Thuật từ/Cách dùng hoặc ngh ĩa tiếng Việt Aa Amino acid Axit amin Bp Base pair Cặp bazơ Ck Chicken Gà CkHG4 A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) Chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà Hậu Giang năm 2005 Da Dalton Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein Dk Duck Vịt DNA Deoxyribonucleic Acid Axit deoxyribonucleic dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate Tiền chất dNTP cho phản ứng giải trình tự ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương thế giới Gs Goose Ngỗng HA Haemagglutinin Ngưng kết hồng cầu HI Hemagglutination Inhibition Ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao Kb Kilo base Kilo bazơ LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy vi khuẩn LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp M Matrix Protein đệm MDk Muscovy duck Ngan MEGA Molecular Evolutionary Genetics Chương tr ình p hân tích tiến hóa VII Analysis gen NA Neuraminidase Enzym phân giải sialic NEP Nuclear Export Protein Protein vận chuyển NP Nucleoprotein Protein nhân NS Non structural protein Protein không cấu trúc OIE Office International des Epizooties Tổ chức Thú y thế giới PA Polymerase acidic protein Enzym polymerase có tính axit PB1 Polymerase basic protein 1 Enzym polymerase có tính bazơ 1 PB2 Polymerase basic protein 2 Enzym polymerase có tính bazơ 2 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Tổ hợp protein liên kết ribonucleic RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Phản ứng PCR ngược SPF Specific Pathogen Free Không chứa mầm bệnh (siêu sạch) (-)ssRNA Negative single-strand Ribonucleic Acid ARN sợi đơn âm TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TNF-α Tumor Necrosis Factor-α Yếu tố α g ây ho ại tử khối u WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới VIII DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên b ảng Trang 1.1 T ổng số trường hợp nhiễm cúm gia c ầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO t ừ tháng 12/2003 đến 6/7/2012 6 2.1 Thành ph ần phản ứng RT -PCR 59 2.2 Chu trình nhi ệt sử dụng trong nghi ên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 60 2.3 Danh sách m ồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm 61 2.4 Thành ph ần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự 68 3.1 Danh sách các ch ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế gi ới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và m ối quan hệ nguồn gốc phả hệ 85 3.2 So sánh v ị trí sai khác nucle otide c ủa gen H5 chủng CkHG4 với 26 ch ủng virus cúm khác 86 3.3 So sánh v ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5 gi ữa 27 chủng virus cúm 87 3.4 T ỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đ ồng về amino acid (d ưới đường chéo) gen H5 gi ữa các chủng cúm A/H5N1 c ủa Việt Nam v à thế giới 90 3.5 Danh sách các ch ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế gi ới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen và m ối quan hệ nguồn gốc phả hệ 94 3.6 So sánh v ị trí sai khác nucleotide c ủa gen N1 chủng CkHG4 với 26 ch ủng virus cúm khác 95 3.7 So sánh v ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1 gi ữa 27 chủng virus cúm 96 3.8 T ỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đ ồng về amino acid (dưới đường chéo) c ủa gen N1 giữa các ch ủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới 100 [...]... tài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang Mục tiêu của đề tài (1) Giải mã được toàn bộ hệ gen gồm 8 phân đoạn của một chủng virus cúm A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang (2) Phân tích được một số đặc điểm sinh học phân tử của hệ gen nhằm thu được thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine phòng bệnh hiệu quả Ý nghĩa khoa học của đề tài - Đây là luận án nghiên cứu. .. hệ thống về sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang - Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu khoa học về virus cúm A/H5N1 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp hiểu biết thêm về tính đa dạng của virus cúm Trên cơ sở đó góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp - Kết quả nghiên cứu. .. vùng gen ổn định làm cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm đầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại vaccine thích hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm Để có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ đó làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen /hệ gen của virus cúm A/H5N1 và nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ. .. phù hợp - Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm đầu tiên dịch xuất hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long 3 Những đóng góp mới của đề tài (1) Giải trình tự và n ghiên cứu hoàn chỉnh , có hệ thống hệ gen của một chủng virus cúm A/H5N1 thuộc thể độc lực cao (HPAI) phân lập từ gà tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng... Orthomyxoviridae được phân thành các nhóm virus cúm A (influenza A virus) , virus cúm B (influenza B virus) , virus cúm C (influenza C virus) và nhóm Thogotovirus dựa vào sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên trong nucleoprotein (NP) và matrix (M1) protein của chúng Virus cúm B và C không phân loại thành các phân týp (subtype) Tất cả virus cúm gia cầm (avian influenza virus) được xếp vào týp A Virus týp A được... dụng gen NP trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.20 117 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen NP chủng CkHG4 so với 26 chủng virus cúm khác 119 X 3.21 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen M trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.22 121 Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen. .. trữ hệ gen của các chủng virus cúm trong Ngân hàng gen (GenBank), cũng như trong Trung tâm dữ 10 liệu các gen virus cúm ISD (Influenza Sequence Database), theo thứ tự ký hiệu: Tên týp virus (serotype)/Loài động vật bị nhiễm/Vùng địa lý phân lập/ Số hiệu đăng ký chủng virus/ Thời gian phân lập/ Loại hình phân týp (HA(H) và NA(N)) Ví dụ: A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) (Hình 1.1A) Đối với các virus được phân. .. cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam hiện nay đã có sự xuất hiện của nhiều clade virus mới làm cho tình hình dịch tễ và định hướng phòng chống dịch trở nên phức tạp hơn 1.1.4 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.4.1 Phân loại và danh pháp của virus cúm 1.1.4.1.1 Phân loại Virus cúm được phân loại chủ yếu dựa theo đặc tính kháng nguyên của virus Virus cúm A gây bệnh cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân. .. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen PA trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.17 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PA chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.18 115 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA giữa 27 chủng virus cúm 3.19 113 116 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế... sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 3.10 So sánh vị trí sai khác nucleotide của gen PB2 chủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác 3.11 103 So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2 giữa 27 chủng virus cúm 3.12 102 104 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và . hành đ ề tài: Nghiên c ứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân l ập từ gà nuôi tại H ậu Giang . M ục t iêu c ủa đ ề t ài (1) Gi ải mã đư ợc toàn b ộ h ệ gen gồm 8 phân đo ạn c ủa một chủng virus cúm A/H5N1. nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36 1.2.4. Các phương th ức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A 38 1.3. Ti ến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 42 1.3.1. S ự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 42 1.3.2 (CkHG4) phân l ập từ gà Hậu Giang 56 2.3.2. Phân tích so sánh thành ph ần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới 56 2.4. V ật liệu nghiên cứu 56 2.4.1.