Đang tải... (xem toàn văn)
Nguyên lý chung: Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển TDNA gắn vào NST tế bào thực vật. Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng TDNA.Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes là hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) (Hình 1và hình 2 ) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm.Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Lý do giới hạn vật chủ này hiện nay còn chưa được biết. Một lần khởi đầu, sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro. Mô khối u tổng hợp amino acid mới và các dẫn xuất của đường được biết chung là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó nhiều dòng Agrobacterium tumefacien phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline. Agropine, một dẫn xuất của đường được tìm thấy phổ biến trong các khối u lông rễ gây ra bởi A. rhizogenes. Agrobacterium chịu trách nhiệm đối với sự hình thành khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine mà nó tổng hợp được và sử dụng opine như là một nguồn cacbon và nitơ.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ KHOA SINH HỌC KHOA SINH HỌC Học phần : Công nghệ sinh học Công nghệ sinh học Kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật ở thực vật Giảng viên hướng dẫn PGS.TS.Trần Quốc PGS.TS.Trần Quốc Dung Dung Huế Huế, ngày 22 tháng 9 Kỹ thuật Kỹ thuật chuyển gen chuyển gen ở ở thực vật thực vật Một số khái niệm cơ bản Chuyển gen Chuyển gen là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và di truyền lại cho đời sau Gen chuyển Gen chuyển ( Transgene Transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền Thực vật chuyển gen Thực vật chuyển gen là thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó Page 4 Tuy nhiên để chuyển gen vào thực vật (vật chủ) một cách có hiệu quả thì, các cấu trúc di truyền cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của gen ngoại lai. Cấu trúc di truyền phải mang một gen chỉ thị chọn lọc gen chỉ thị chọn lọc hoặc sàng lọc sàng lọc. Một cấu trúc di truyền cơ bản bao gồm : trình tự khởi động (promoter), gen mã hóa (coding gene) và trình tự kết thúc (terminator). Hai promoter chủ yếu thường được sử dụng cho biến nạp gen ở thực vật Promoter CaMV 35S Promoter CaMV 35S thích hợp cho sự biểu hiện của DNA ngoại lai ở cây hai cây hai lá mầm lá mầm và promoter ubiquitin promoter ubiquitin của ngô thích hợp cho sự biểu hiện mạnh của cây một lá mầm. cây một lá mầm. Một số khái niệm cơ bản Một số khái niệm cơ bản MỤC ĐÍCH QUÁ TRÌNH MỤC ĐÍCH QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN Ở THỰC CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VẬT Mục đích quá trình chuyển gen Mục đích quá trình chuyển gen Nghiên cứu làm sáng tỏ chức năng của một gen được quan tâm hay từng phần của gen đó. Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào. Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu nhận được thu nhận được các tính trạng mới các tính trạng mới ở tế bào và cây được chuyển gen. Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) và cà Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) và cà chua đối chứng (bên trái) chua đối chứng (bên trái) Quy trình chuyển gen Phân lập gene 2 Biến nạp vào E.coli 4 Xác định gene và tính trạng 31 Gắn gene vào vector biểu hiện 33 Quy trình chuyển gen Biến nạp vào mô hoặc tế bào 6 Phân tích cá thể chuyển gen 8 Tách chiết DNA plasmid 35 Chọn lọc và tái sinh cây b.nạp 37 Các nguyên tắc sinh học cơ bản của việc chuyển gen Không phải toàn bộ các tế bào đều thể Không phải toàn bộ các tế bào đều thể hiện hiện tính toàn năng. tính toàn năng. Các cây khác nhau có Các cây khác nhau có phản ứng phản ứng không giống nhau không giống nhau với sự xâm nhập của một với sự xâm nhập của một gen ngoại lai. gen ngoại lai. Cây biến nạp Cây biến nạp chỉ có thể được tái sinh chỉ có thể được tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và có khả từ các tế bào có khả năng tái sinh và có khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome năng thu nhận gen biến nạp vào genome [...]... nội sinh bằng bất lai Phương pháp chuyển gen ở thực vật 1 Chuyển gen qua trung gian PPCG 2 Chuyển gen trực tiếp Chuyển gen qua trung gian Phương pháp này được thực hiện nhờ vi khuẩn tạo khối u ở thực vật, chủ yếu qua T-plasmid Dựa vào cơ chế vi khuẩn Argobacterium sau khi xâm nhiễm vào tế bào , chúng gắn các đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn dưỡng chất nội sinh, ... A.tumefaciens) A.tumefaciens hay rễ tơ (A.rhizogenes) Khả năng chuyển gen A.rhizogenes này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào thực vật theo ý muốn Vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật A.tumefaciens có chứa 1 plasmid lớn kích thước... gen trực tiếp Có nhiều phương pháp sử dụng như lyposome, điện biến nạp (electroporation), vi tiêm, bắn gen, dùng silicon carbide, chuyển gen trực tiếp vào protoplast Chuyển gen bằng vi đạn (Bắn gen) Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới Nguyên lý của nó là sử dụng các viên đạn có kích thước hiển vi, có tỷ... chuyển gen này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản, không cần có vector Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được.Tuy nhiên việc tạo protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường Với phương pháp các nhà khoa học đã... thành công vào một số Page 34 cây một lá mầm như loàilúa phụ Japonica (Datta,1990), Ưu điểm - Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công - Không đỏi hỏi thiết bị đắt tiền Nhược điểm - Tần số chuyển gene rất thấp do không kiểm soát được quá trình chuyển gene - Dễ xảy ra hiện tượng dung hợp TB trần, gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gene - Tái sinh tế bào trần sau chuyển. .. glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm Gen lacZ : là gen mã hóa cho enzyme β-galactosidase có khối lượng phân tử 116 kD Gen lacZ ở E.coli được dùng rất phổ biến trong công nghệ gen và đã có sẵn của hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử XGal Sự tồn tại của lacZ trong tế bào thực vật đã được Gal khẳng định Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phảiPage 14 hoạt gen lacZ... sinh học cơ bản của chuyển gen Mô thực vật là " hỗn hợp các quần thể tế bào "có khả năng khác nhau Thành phần của "quần thể tế bào" được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gene Các DNA (trừ virus) không chuyển. .. tượng chuyển gen - Tần số biến nạp ổn định thấp Chuyển gen trực tiếp vào protoplast Để DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Protoplast có thể được duy trì trong môi trường được nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ tế bào này Quá trình chuyển. .. có kích thước khoảng 25kb trong đó có chứa đoạn gen mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine là các gen gây nên khối u (oncogenes) Trong Ti-plasmid,vị trí của T- DNA được giới hạn bằng RB và LB Vùng Vir là vùng phụ trách khả năng lây nhiễm Page 25 Page 26 Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp qua Agrobacterium Chuyển gen trực tiếp Có nhiều phương pháp sử dụng như lyposome,... bắn gen Khi bắn áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao xuyên Page 28 tế bào Một tỷ lệ DNA ngoại vào s Sơ đồ súng bắn gen Page 29 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen Page 30 Thao tác chuyển gen bằng phương thức dội bom Page 31 Ưu điểm Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế bào và mô Bắn một lần được nhiều tế bào Quá trình chuyển gen nhanh, thao tác đơn giản Các vector mang gene . ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ KHOA SINH HỌC KHOA SINH HỌC Học phần : Công nghệ sinh học Công nghệ sinh học Kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật ở thực. ĐÍCH QUÁ TRÌNH MỤC ĐÍCH QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN Ở THỰC CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VẬT Mục đích quá trình chuyển gen Mục đích quá trình chuyển gen Nghiên cứu làm sáng tỏ chức năng của một gen được. ( Transgene Transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền Thực vật chuyển gen Thực vật chuyển gen là thực vật có gen ngoại lai (gen chuyển)