DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis 5 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 16 Bảng 3.4: Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [19],[30] 16 Bảng 3.5: Môi trường thử hoạt tính của enzyme protease [24] 16 Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose 16 Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar 17 Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate 17 Bảng 3.9: Môi trường lòng đỏ trứng 17 Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs 18 Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28 Bảng 4.2: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập 33 Bảng 4.3 : Kết quả đo bán kính vòng phân giải casein của 10 chủng vi khuẩn phân lập (mm) 36 Bảng 4.4 : Kết quả đo tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng 37 Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 38 Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40 Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của KTC1 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 26 Hình 4. 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn phân lập được 32 Hình 4.2. Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis 34 Hình 4.3 : Vòng phân giải casein của chủng KTB2, KTB4, KTC1 36 Hình 4.4 : Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn KTC1 39 Hình 4.5: Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KTC1 40 Hình 4.6: Đồ thị biểu hiện sự ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của KTC1 42 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT THUẬT NGỮ VIẾT TẮT DIỄN GIẢI h giờ MPA Malt-Peptone-Agar OD Optical Density VSV Vi sinh vật MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Ý nghĩa của đề tài 2 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái 4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy 4 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá 5 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 5 2.2. Giới thiệu về enzyme protease 6 2.2.1. Tổng quan về enzyme Protease 6 2.2.2 Phân loại và đặc điểm của protease 7 2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 8 2.2.4. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật 9 2.2.5. những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus nói chung và Bacillus subtilis nói riêng 12 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1. Đối tượng khảo sát 14 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 14 3.2.1. Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014 14 3.2.2. Địa điểm 14 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 14 3.3.1. Hóa chất 14 3.3.2. Thiết bị và dụng cụ 14 3.3.3 Môi trường sử dụng 15 3.4. Nội dung nghiên cứu 18 3.5. Phương pháp thực hiện đề tài 18 3.5.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 18 3.5.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 23 3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn 26 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28 4.1.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 32 4.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease 35 4.2.1 Kết quả khảo sát vòng phân giải của 10 chủng phân lập được 35 4.2.2. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của 3 chủng KTB2, KTB4, KTC1. 37 4.3. Kết quả nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme prorease của vi khuẩn KTC1. 38 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của chủng vi khuẩn KTC1. 38 4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme protease của chủng vi khuẩn KTC1 39 4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của chủng vi khuẩn KTC1 41 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1. Kết luận 43 5.2. Kiến nghị 43 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học là một dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột. Tác dụng của chế phẩm sinh học là làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme, tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng, trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính (Lã văn kính, 1998) [7]. Protease là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi trong chế phẩm sinh học. Người ta có thể thu enzyme protease từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên thu enzyme từ cơ thể động vật hay thực vật thì rất khó khăn và tốn kém vì thường phải phá bỏ tổ chức để thu enzyme và quá trình bảo quản rất phức tạp. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzyme có hoạt tính cao. Chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzyme từ các nguồn nguyên liệu khác nhau hẳn [12]. Vì vậy vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất tiềm năng. Trong các nguồn thu protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis vì loài vi khuẩn này rất phổ biến dễ phân lập, thu enzyme và enzyme thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn (Nguyễn Thị Hiền và cs 2004) [7]. 1 Từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Phân lập tuyển chọn các chủng của Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi. 1.3. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học Phân lập được loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn được chủng có khả năng sinh protease. Biết và hiểu rõ hơn về các thoa tác kĩ thuật cũng như các thông số quy trình công nghệ trong quá trình thực hiện đề tài. - Ý nghĩa thực tiễn + Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu càng cao của ngành chăn nuôi. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm [9]. 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis - Đặc điểm phân loại: Theo Vũ Thị Thứ, (1996) [19]. Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis http://www.isciencemag.co.uk/blog/tasty-humans/attachment/bacillus-subtilis/ 3 - Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis [19]. 2.1.3. Đặc điểm hình thái - Đặc điểm hình thái tế bào Bacillus subtilis là trực khuẩn, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ [1]. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Trên môi trường thạch đĩa MPA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường thạch nghiêng MPA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng. Trên môi trường gelatin: khuẩn lạc phát triển và làm tan chảy gelatin. Trên thạch khoai tây: khuẩn lạc phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. Trên môi trường canh MPA: khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều. [1]. 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy. Chúng phát triển tốt trên môi trường MPA với nhiệt độ tối ưu là 37 o C, pH = 7,0 - 7,4 [19]. 4 [...]... Thử các phản ứng sinh hóa để tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis - Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh protease cao - Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được 3.5 Phương pháp thực hiện đề tài 3.5.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19 3.5.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng. .. 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn 3.5.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn 27 Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo enzyme của các chủng vi khuẩn theo phương pháp của Phạm Thị Ánh Hồng (2003)... và bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis [14] Năm 2004 Đỗ Thị Bích Thủy đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis [20] Năm 2013 Trần Ngọc Hùng, Lê Phi Nga đã nghiên cứu thu Protease từ Bacillus subtilis sử dụng trong chế phẩm sinh học trong chăn nuôi [10] Năm 2010 Nguyễn Văn Rư và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy và... enzyme protease từ chủng Bacillus subtilis Năm 2009 Nguyễn Thị Trần Thụy đã nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm Năm 2009 Phan Trương Hương Thảo đã nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số đặc tính của enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis Năm 2007 Bùi Thị Phi đã nghiên cứu phân lập khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh enzyme của. .. môi trường có màu xanh dương 3.5.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 3.5.2.1 Xác định khả năng thủy phân protein Chúng tôi tiến hành xác định khả năng thủy phân protein theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận (1976) [3] Phương pháp này dùng để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn thu được Cách tiến hành : Nuôi vi khuẩn trong môi... và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quí 2.2.5 những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus nói chung và Bacillus subtilis nói riêng 2.2.5.1 Trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thu nhận protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis làm cơ sở để sản xuất các sản phẩm sinh học phục vụ cho con người và các động vật Năm... vi sinh vật Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật 2.2.4 Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh. .. thêm protease sẽ làm tăng hương vị của sản phẩm Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị thịt sau khi chế biến Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng hương vị thịt Việc thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm phụ khác Người ta cũng sử dụng protease. .. xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá thể trồng nấm, nuôi giun Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu tố dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây 12 trồng trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có thể ủ thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật Nhiệt độ của các đống ủ khoảng... xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da và để sản xuất thức ăn kiêng) 10 Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat Protease làm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomat khác nhau Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin Vì thế, ta có thể giảm giá thành trong sản xuất phomat [7] Dùng protease của . Phân lập tuyển chọn các chủng của Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi . 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển. tuyển chọn được các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi. 1.3. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học Phân lập được. Bacillus subtilis từ các mẫu đất 28 4.1.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 32 4.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả