Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men

47 641 3
  • Loading ...
1/47 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 17/08/2014, 17:02

MỤC LỤC 2.1.1. Phân loại vi khuẩn lactic 7 2.1.1.1. Theo Orla-Jensen (1919) [2] 8 2.1.1.2. Phân loại theo hình dạng tế bào [2] 8 2.1.1.3. Phân loại theo cách thức lên men [9] 8 2.1.1.4. Phân loại dựa vào nhiệt độ 9 2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 9 2.1.1.1. Đặc điểm sinh lý 9 2.1.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ đường 11 2.1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 11 2.1.4. Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic 12 2.1.4.1. Trong công nghệ thực phẩm 12 2.1.4.2. Trong công nghiệp 12 2.1.4.3. Trong nông nghiệp và môi trường 13 2.1.4.4. Trong y học 13 2.1.4.5. Trong mỹ phẩm 13 2.1.4.6. Trong chăn nuôi thú y 13 PHẦN 3 27 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 27 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 27 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 27 3.3.1. Hóa chất 27 Bảng 3.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 27 3.3.2. Thiết bị sử dụng 28 Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 28 3.6. Phương pháp sử lý số liệu 32 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 34 4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 34 Hình 4.4. Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin của BL1 40 1 Kết quả trong bảng 4.5 và biểu đồ 4.4 cho thấy NaCl ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1. Ở nồng độ 0,5%, vi khuẩn BL1 phát triển tốt nhất OD610 = 1,8 tuy nhiên khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị không phải là tốt nhất kích thước vòng kháng khuẩn đạt 9 – 16 mm , ở nồng độ 1% thì sự phát triển không phải là tốt nhất OD610 = 1,5 nhưng khả năng ức chế các vi khuẩn chỉ thị lại cao kích thước vòng kháng khuẩn đạt 9 – 18 mm. Khả năng kháng khuẩn và sinh trưởng của chủng BL1 giảm mạnh nếu không bổ sung NaCl vào môi trường, còn khi tăng nồng độ NaCl lên 1,5% thì sự sinh tổng hợp bacteriocin và sự sinh trưởng giảm OD610 = 0,9 kích thước vòng kháng khuẩn là 9 – 18 mm 40 Vì vậy nồng độ NaCl thích hợp cho sự sinh tổng hợp bacteriocin là 1% 40 PHẦN 5 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1. Kết luận 41 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Error: Reference source not found Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm . . Error: Reference source not found Bảng 4.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactic 29 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 30 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 31 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 32 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của NaCl tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 34 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc của Nisin Z Error: Reference source not found Hình 2.2: Cấu trúc Sakacin P Error: Reference source not found Hình 3.1: Phương pháp cấy khảo sát khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị Error: Reference source not found Hình 4.1. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn BL1 30 Hình 4.2. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 31 Hình 4.3. Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn BL1 33 Hình 4.4. Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin của BL1 34 4 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong cuộc sống hằng ngày chúng ta thì vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men hằng ngày như dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, pho mai, bia [3]. Nó có vai trò quan trọng trong đời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế các vi sinh vật có hại, bổ sung các vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn Và gần đây có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở riboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương [20]. Nó có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại [29]. Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứng dụng, trong mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong y học và trong công nghệ thực phẩm [22]. Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá và còn sử dụng trong điều trị kháng sinh đồ[30] Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin được sử dụng trong thành phần của một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm.Trong công nghệ thực phẩm, bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp [26] Ở Việt Nam hiện nay có nhiều nghiên cứu về sinh tổng hợp bacteriocin từ nem chua, sữa chua, dưa chua Trong bài này tôi “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men”. 5 1.2. Mục đích của đề tài Đánh giá được khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza và xác định ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn. 1.3. Mục tiêu của đề tài Khảo sát được khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus) của các vi khuẩn lactic phân lập từ Boza. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men tới quá trình tổng hợp bacteriocin: thời gian lên men, pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Xác định được khả năng kháng các vi khuẩn độc hại và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành bacteriocin của vi khuẩn lactic từ Boza, làm cơ sở để có những nghiên cứu tiếp theo về chủng loại bacteriocin và ứng dụng trong thực tế. Đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích và tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Là cơ sở để nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn đã phân lập trong sản xuất bacteriocin ứng dụng trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm. Khẳng định vai trò có lợi của đồ uống lên men Boza đối với con người. 6 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hình que hoặc hình cầu, có khả năng lên men đường thành acid lactic. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hoặc đôi khi khuẩn lạc có kính thước to, tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc có thể tỏa ra mùi chua của acid. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae thuộc bộ Eubacteriales [2]. Chúng trao đổi chất và phần lớn sản phẩm cuối của quá trình lên men cacbonhydrat là axit lactic [1]. Theo Nguyễn Thành Đạt (2007) tất cả những vi sinh vật lactic đều có các đặc điểm sau: Đó là những vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, có hoạt tính catalaza, oxydaza, nitratoreductaza âm tính. Tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sự sống nhưng rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, nhiều bazơ nucleic, nhiều vitamin… Không có khả năng tổng hợp nhân hem của các porphyrine, bình thường chúng không có cytochrome. Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, là loại có khả năng lên men hiếu khí cũng như lên men kị khí. Có khả năng chống chịu tốt trong môi trường acid. Vi khuẩn lactic phân bố tương đối rộng trong tự nhiên, đặc biệt trong các sản phẩm lên men. Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong đất, trong nước, trên bề mặt thực vật, trong các sản phẩm lên men (sữa chua, format,…), các sản phẩm rau muối chua, trong đường tiêu hóa của người và động vật, trong các sản phẩm thịt [2,8]. 2.1.1. Phân loại vi khuẩn lactic 7 Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau. Để phân loại người ta dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau, căn cứ vào đặc điểm hình thái, phương thức lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm. 2.1.1.1. Theo Orla-Jensen (1919) [2] Chia làm 4 loài chính: Lactobacillus. Leuconostoc. Pediococcus. Streptococcus. Ngày nay người ta mới bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium (Kandler và Welss, 1986). 2.1.1.2. Phân loại theo hình dạng tế bào [2] Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium. Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus. Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que), Bifidobacterium. Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus). Hình dạng và sự sắp xếp tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy 2.1.1.3. Phân loại theo cách thức lên men [9] Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng axit lactic tạo ra chủ yếu 85 – 90%. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolaza nhưng không có enzyme phosphoketolaza. Nhóm vi khuẩn này gồm các cầu khuẩn Streptococcus lactic như là Streptococcus cremoris, các trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium bulgaricus. 8 Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng axit lactic lên men chiếm tỉ lệ thấp khoảng 50%, các axit hữu cơ khác như axit acetic, axit formic… và CO 2 . Nhóm vi khuẩn lactic này không có enzyme aldolaza nhưng lại có enzyme phosphoketolaza. Ví dụ: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus. 2.1.1.4. Phân loại dựa vào nhiệt độ Chia làm 3 loại [10,11]: Ưa lạnh: 0 – 27 o C Ưa ấm: 5 – 45 o C Ưa nhiệt: 20 – 60 o C Ngoài ra còn có thể phân loại vi khuẩn lactic theo một số đặc điểm sau [5]: Khả năng chịu muối. Khả năng sinh tổng hợp các đồng phân khác nhau của axit lactic. Phân loại dựa vào tỷ lệ phần trăm của các bazơ Guamin (G) + Cytosin (C) (%GC). Các loài thuộc giống Streptococcus có tỷ lệ %GC 34-46%, Leuconostoc 36-43%, Pediococuss 34-43%… [2]. 2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 2.1.1.1. Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về sinh lý tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử, hầu hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh axit lactic. Axit lactic sinh ra dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL [1,7]. Tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men bắt buộc, không chứa enzyme catalaza, cytochrome, hô hấp tùy tiện. Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu cao về môi trường dinh dưỡng, ngoài đường, muối khoáng, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin 9 (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) và các axit amin. Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn lactic thay đổi tùy từng loài, hình thái còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường, thời gian lên men, sự có mặt của oxi và các tác nhân khác. 2.1.1.2. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn lactic Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Cacbon là thành tố chính xây dựng nên cơ thể của mọi sinh vật. Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng rất nhiều loại hydratcacbon khác nhau, chúng dễ dàng lên men các loại đường đơn (monosaccharide) như glucose, fructose, mantose, galactose. Với các loại đường đôi (disaccharide) như saccharose, mantose… thì được đồng hóa một cách chọn lọc hơn. Đối với các loại polysaccharide như dextrin, tinh bột… chỉ một số loài mới có khả năng đồng hóa. Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì đỏi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước áp lực của các quá trình xử lý sau này. Chẳng hạn khả năng sống sót của L. burgaticus sau khi sấy đông khô cao hơn khi sử dụng đường fructose và lactose so với mannose. L.delbruceckii có thể sử dụng đường glucose, galactose, mantose, saccharose nhưng không sử dụng được lactose, rafinose [4,7]. Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của mọi sinh vật. Những vật chất cơ bản của tế bào protein, axit nucleic… đều chứa nitơ vì vậy nitơ đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng nitơ phức tạp. Phần lớn vi khuẩn lactic 10 [...]... dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị của 5 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ Boza Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic Nội... khuẩn gram âm ở chỗ là: vi c tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [14] Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm, điển hình là E coli sinh tổng hợp colicin [28] Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng... đã nghiên cứu các vi khuẩn lactic ( LAB) phân lập từ nhiều môi trường khác nhau và thấy rằng các chủng vi khuẩn này sinh ra bacteriocin có khả năng ức chế Aspergillus fumigatus và 4% tiết bacteriocin có hoạt tính kháng loại mốc này rất mạnh [21] 25 2.3 Tình hình nghiên cứu 2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Hiện nay ở nước ta vi c nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đã... hoạt động của bacteriocin 2.2.4.1 Phạm vi hoạt động Phạm vi hoạt động của bacteriocin được xem xét dựa trên phạm vi kháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính ổn định, tính chất hóa sinh và kiểu hoạt động của bacteriocin Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram... Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị của vi khuẩn nghiên cứu [29] Tiến hành cấy ria các chủng vi khuẩn lactic lên đĩa thạch chứa môi trường LBA theo đường thẳng nằm giữa đĩa thạch Sau 2 ngày nuôi... hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển cũng như sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học của vi khuẩn Để đánh giá được ảnh hưởng của thời gian tới khả năng tổng hợp bacteriocin, vi khuẩn BL1 được nuôi trong môi trường LB với các thời gian 12h, 24h, 36h và 48h Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.2 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của. .. bacteriocin của vi khuẩn BL1 36 Từ bảng 4.2 và biểu đồ 4.1 cho thấy, thời gian ảnh hưởng rõ đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng như tốc độ phát triển của chủng lactic BL1 Thời gian từ 12h - 36h sự sinh trưởng của vi khuẩn BL1 tăng OD 610 tăng từ 0,7 - 1,5 sau 36h thì chuyển sang pha cân bằng OD610 = 1,8, sự sinh tổng hợp bacteriocin ở 12h nuôi cấy khả năng kháng khuẩn yếu hàm lượng bacteriocin. .. (well diffusion agar) Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của bacteriocin với vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn acid lactic trên môi trường nuôi cấy Bacteriocincó khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn acid lactic sinh bacteriocin kháng được vi khuẩn chỉ thị sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch Quy trình thực hiện: Chuẩn bị... một nghiên cứu khác của Suranjita Mitra et al, 2005 khảo sát trên chủng Lc Lactics phân lập từ sữa lên men trên môi trường có pH ban đầu là 6,5 ở nhiệt độ là 37 oC kết quả cho thấy khả năng sinh tổng hợp cao nhất là sau 7 giờ Hay nghiên cứu của L.G Stoyanova et al., 2005 thời gian tổng hợp bacteriocin cao nhất là sau 12 giờ ở môi trường nuôi cấy ban đầu có pH ban đầu là 7.0 ở 30oC Hay nghiên cứu của. .. âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm : 15 Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [25] Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram . Ở Vi t Nam hiện nay có nhiều nghiên cứu về sinh tổng hợp bacteriocin từ nem chua, sữa chua, dưa chua Trong bài này tôi Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập. phân lập từ bột lúa mạch lên men . 5 1.2. Mục đích của đề tài Đánh giá được khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza và xác định ảnh hưởng của các. hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 30 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 31 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men, Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men, Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ khóa liên quan

Mục lục

Xem thêm

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay