i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác ii LỜI CÁM ƠN Để hồn thành luận văn này, trước hết tơi xin chân thành cảm ơn thầy GS TSKH Nguyễn Trọng Cẩn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô giáo Khoa Chế biến, trường Đại học Nha Trang Lãnh đạo cán phụ trách PTN Trung tâm CL Nông lâm sản vùng Đặc biệt đồng nghiệp, người thân tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Do hạn chế kiến thức thân điều kiện khách quan nên luận văn không tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận nhận xét, góp ý q thầy đồng nghiệp để luận văn hoàn thiện Một lần xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 06 năm 2010 Học viên thực Phạm Duy Linh iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AAS : Atomic Absorption Spectrophotometric ATVS : An toàn vệ sinh thực phẩm ASP : Amnesis Shellfish Poisioning BVNL : Bảo vệ nguồn lợi DSP : Diarrhetic Shellfish Poisoning EDTA : Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid EU : Erope Union HPLC : High-pressure liquid chromatography NLS : Nông lâm sản NN&PTNN : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn OA : Okadaic acid PSP : Paralytic Shellfish Poisoning QLCL : Quản lý chất lượng STX : Saxitoxin TS : Thủy sản iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN .ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯƠC VỀ NGHÊU 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Thành phần hóa học nghêu 1.2 TÌNH HÌNH PHÂN BỐ CỦA NHUYỄN THỂ MẢNH VỎ 1.3 BÃI NGHÊU Ở HUYỆN TRẦN VĂN THỜI – CÀ MAU 1.4 ẢNH HƯỞNG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NUÔI ĐẾN CHẤT LƯỢNG CỦA NGHÊU THƯƠNG PHẨM 10 1.5 ẢNH HƯỞNG CÁC LỒI TẢO ĐỘC CĨ TRONG MƠI TRƯỜNG NI MÀ NGHÊU ĂN VÀO TÍCH TỤ Ở CƠ THỊT 12 1.6 SỰ TÍCH TỤ CÁC KIM LOẠI NĂNG TRONG NHUYỄN THỂ 15 1.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NGHÊU (Meretrix lyrata) 17 1.7.1.Các cơng trình nghiên cứu nước 17 1.7.2 Các cơng trình nghiên cứu nước 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP THU MẪU VÀ XỬ LÝ MẪU 21 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.3.1 Phương pháp phân tích hoá học .23 2.3.2 Xác định vi sinh vật gây bệnh có nguyên liệu nghêu 26 2.4 Thiết bị hoá chất sử dụng luận văn 26 v 2.4.1 Hoá chất .26 2.4.2.Thiết bị sử dụng chủ yếu .26 2.5 Phương pháp xử lý số liệu .27 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28 2.6.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 28 2.6.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra vi sinh vật .29 2.6.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra độc tố sinh học 30 2.6.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra kim loại nặng 31 CHƯƠNG 03: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHỈ TIÊU VI SINH VẬT .32 3.1.1 Biến đổi vi sinh vật Fecal coliform theo thời gian nuôi 32 3.1.2 Biến đổi vi sinh vật tổng số hiếu khí (TPC) theo thời gian nuôi 33 3.1.3 Biến đổi vi sinh vật Salmonella theo thời gian nuôi 34 3.1.4 Biến đổi vi sinh vật Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus theo thời gian nuôi 35 3.1.5 Phân loại vi sinh sơ vùng thu hoạch .36 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC LOẠI ĐỘC TỐ 37 3.2.1 Sự biến đổi độc tố gây trí nhớ (ASP) theo thời gian sinh trưởng nghêu .37 3.2.2 Sự biến đổi độc tố gây tiêu chảy (DSP) theo thời gian sinh trưởng nghêu .38 3.2.3 Sự biến đổi độc tố gây liệt (PSP) theo thời gian sinh trưởng nghêu 39 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG KIM LOẠI NẶNG Cd+2, Pb2+, Hg2+ THEO THỜI GIAN NUÔI 40 3.4 ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG NGUỒN NUÔI NGHÊU NGUYÊN LIỆU 42 3.4.1 Sơ đồ kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu nghêu .42 vi 3.4.2 Nhiệm vụ quan hệ thống .43 3.5 THIẾT LẬP VÀ THỰC HIỆN CHƯƠNG TRÌNH ĐẢM BẢO VỆ SINH AN TỒN THỰC PHẨM TRONG Q TRÌNH NI NGHÊU .44 3.5.1 Giám sát định kỳ tiêu ATVS vùng thu hoạch nhuyễn thể mảnh vỏ 44 3.5.2 Điều kiện phép thu hoạch Chế độ xử lý sau thu hoạch .46 3.5.3 Kiểm soát thu hoạch 46 3.5.3.1 Cơ chế kiểm soát bao gồm 47 3.5.3.2 Thực kiểm soát thu hoạch .47 3.5.4 Kiểm soát ATVS bảo quản, vận chuyển nhuyễn thể hai mảnh vỏ 48 3.5.4.1 Phương tiện bảo quản, vận chuyển .48 3.5.4.2 Điều kiện bảo quản, vận chuyển 49 3.5.5 Kiểm soát điều kiện ATVS sở làm sạch/ ngâm loại bỏ tạp chất 49 3.5.5.1 Cơ sở ngâm loại bỏ tạp chất cho nhuyễn thể mảnh vỏ .49 3.5.5.2 Cơ sở làm nhuyễn thể mảnh vỏ 49 3.5.6 Kiểm soát ATVS sở chế biến .49 3.5.7 Kiểm tra thành phẩm, cấp chứng thư xuất xưởng 51 3.5.8 Xử lý khiếu nại triệu hồi lô hàng .52 3.5.8.1 Lưu mẫu .52 3.5.8.2 Xử lý khiếu nại: thông tin người khiếu nại cần cung cấp .52 3.5.8.3 Triệu hồi xử lý lô hàng .52 3.5.9 Xây dựng kế hoạch kiểm soát hàng năm 52 3.5.10 Thẩm tra hệ thống kiểm soát 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54 Kết luận: 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tình hình ni nhuyễn thể Việt Nam Bảng 1.2 Các nguồn gây nhiễm ion kim loại môi trường nước nuôi 16 Bảng 3.1 Kết phân tích vi sinh vật Salmonella theo thời gian ni 35 Bảng 3.2 Kết phân tích vi sinh vật Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus theo thời gian nuôi 35 Bảng 3.3 Phân loại vùng nguyên liệu nghêu theo tiêu chuẩn vi sinh 36 Bảng 3.4 Biến đổi hàm lượng ion Cd+2, Pb2+ , Hg2+ theo thời gian nuôi nghêu 40 Bảng 3.5 Mức giới hạn cho phép tiêu 45 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh bên ngồi nghêu Hình 1.2 Hình ảnh bên nghêu Hình 1.3 Vị trí bãi Nghêu huyện Trần Văn Thời vào mùa mưa 10 Hình 1.4 Vị trí bãi Nghêu huyện Trần Văn Thời vào mùa khô 10 Hình 3.1 Biến đổi vi sinh vật Fecal coliform theo thời gian ni 32 Hình 3.2 Biến đổi tổng vi sinh vật hiếu khí theo thời gian ni 33 Hình 3.3 Biến đổi hàm lượng độc tố gây trí nhớ (ASP) theo thời gian sinh trưởng nghêu 37 MỞ ĐẦU Việt Nam có bờ biển dài 3260 km, vùng biển kinh tế đặc quyền triệu km2, vùng nước nước lợ có khả ni trồng thủy sản triệu ha, nguồn lợi thủy sản phong phú đa dạng Từ năm đầu thập niên 90, kỷ 20, Chính phủ xác định thủy sản ngành kinh tế mũi nhọn Thực chủ trương trên, liên tục 15 năm qua, ngành thủy sản đạt tốc độ tăng trưởng cao, cụ thể năm 1991 giá trị kim ngạch đạt 11,2 triệu USD, năm 2007 giá trị kim ngạch đạt 3.752 triệu USD Trong năm gần đây, ngành thủy sản Việt Nam phát triển khơng ngừng Sự phát triển nhờ vào chủ động nguồn nguyên liệu, với điều kiện thuận lợi tự nhiên, đặc biệt thuận lợi tỉnh Đồng song Cửu long Thế mạnh phát triển nay, dựa sản phẩm chủ lực Tôm, Cá, Nghêu, Bạch tuộc, nhuyễn thể hai vỏ Hầu hết, thủy sản Việt Nam xuất vào thị trường EU, Mỹ, Canada, số thị trường Châu Á có nhu cầu sản lượng lớn Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Thái Lan Trong tất thị trường xuất khẩu, thị trường EU yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm thuỷ sản nghiêm ngặt nhất, đồng thời quản lý có hệ thống chặt chẽ Thị trường EU yêu cầu phải thực kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm thủy sản từ vùng ni Vì vậy, việc thực chương trình kiểm sốt vi sinh vật, độc tố kim loại nặng sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ yêu cầu cần thiết Tuy nhiên, việc kiểm sốt tập trung tỉnh có sản lượng lớn, vùng có sản lượng nhỏ chưa quan tâm Do đó, đề tài “Nghiên cứu biến động vi sinh vật, độc tố kim loại nặng, thiết lập biện pháp đảm bảo vệ sinh an toàn nguyên liệu nghêu (Meretrix lyrata) Cà Mau” cần thiết, góp phần đẩy mạnh việc quản lý chất lượng nguyên liệu thủy sản xuất Mục đích luận văn Nghiên cứu biến động số vi sinh vật, độc tố kim loại nặng nguyên liệu Nghêu qúa trình ni Từ kết nghiên cứu thu đề xuất biện pháp kiểm soát chất lượng nghêu nguyên liệu đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu biến động vi sinh vật trình nuôi: vi sinh vật tổng số, Fecal coliform, Samonella, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến tích tụ ion kim loại nặng: Pb2+, Hg2+, Cd2+ Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến tích tụ: độc tố gây trí nhớ ASP, độc tố gây tiêu chảy DSP, độc tố gây liệt PSP Từ kết đề xuất (thiết lập) biện pháp kiểm soát mối nguy nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho nguyên liệu nghêu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Xác định biến động số vi sinh vật nguy hiểm, độc tố sinh học, kim loại nặng trình sinh trưởng nghêu Từ xác định qui luật biến đổi chúng Đây sở đề xuất biện pháp kiểm sốt mối nguy nhằm đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm Kết luận văn áp dụng vào công việc quản lý quan hành chính, nhằm đề xuất thời gian thu hoạch nghêu thích hợp đảm bảo tính kinh tế an tồn vệ sinh sản phẩm Kết phân tích mẫu bảo quản sau 24 coi khơng có giá trị Thể tích mẫu tối thiểu 100 ml cho lấn thử Mẫu chứa lọ thủy tinh hay bao polypropylene vô trùng Mẫu nhuyễn thể sống phải vận chuyển phịng thí nghiệm biện pháp nhanh Mẫu lấy từ thịt dịch nhuyễn thể từ 10 cá thể (khoảng 150-250g) Mẫu nhuyễn thể vỏ rửa Dùng dụng cụ vô trùng lấy khoảng 100g thịt chất dịch cho vào cốc vô trùng Thêm vào khối lượng dung dịch pha loãng khối lượng mẫu lấy Dập mẫu Stomacher 120 giây Cân 20g dịch huyền phù đồng thêm vào 80g dung dịch pha lỗng để có dung dịch mẫu pha loãng 1/10 * Những ý xử lý mẫu Các tác nhân kháng sinh hay chất ức chế phát triển vi khuẩn như: chlorine, bạc, chì, hay hợp chất hữu khác làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn mẫu Ngược lại, hợp chất dinh dưỡng khác nhiễm vào mẫu làm tăng số lượng vi khuẩn Để hạn chế trường hợp cần có biện pháp sau:  Các dụng cụ dùng lấy mẫu phải  Các dụng cụ dùng để phân tích phải vơ trùng  Mẫu tiến hành phân tích sau lấy  Nhiệt độ nuôi cấy quan trọng, thay đổi nhỏ nhiệt độ làm cho kết sai lệch  Nước cất dùng để pha chế môi trường không bị nhiễm nấm loại vi tảo Thiết bị:  Bể điều nhiệt 44,5  0,2oC  Tủ ấm 35,0  0,5oC  Nồi hấp trùng  Máy dập mẫu  Dao cứng có mũi nhọn Môi trường:  Canh thang Lauryl Tryptose Broth (LTB) nồng độ kép  Canh thang Lauryl Tryptose Broth (LTB) nồng độ thường  Canh thang EC  Dung dịch pha loãng (dung dịch đệm pH khoảng 7,2) Qui trình kiểm nghiệm: 6.1 Phân tích Fecal colifom nước: Cấy vào hệ thống gồm: ống canh thang LTB (có nồng độ kép) ống 10 ml, ống canh thang LTB ống ml; ống canh thang LTB ống 0,1 ml Trường hợp mẫu nước bẩn, cần phải pha loãng mẫu tùy theo kinh nghiệm kiểm nghiệm viên Ủ ống 35,0  0,5oC Đọc kết sau 24 ± 48 ± nuôi cấy Các ống nghiệm có phát triển vi khuẩn, có sinh coi dương tính Cấy chuyền từ ống LTB dương tính sang mơi trường EC, ủ 44,5  0,2oC 24 Các ống dương tính cho thấy có phát triển vi sinh vật tượng sinh Dựa vào số lượng ống EC dương tính tra bảng MPN để có số lượng Fecal colifom 100 ml mẫu 6.2 Phân tích Fecal coliform thịt dịch nhuyễn thể mảnh vỏ: Dùng dịch mẫu pha loãng 1/10 làm dịch cấy Phương pháp cấy tương tự phương pháp MPN dùng cho nước Dùng bảng MPN để ước đoán số lượng vi sinh vật có 100 ml dịch mẫu Số lượng vi sinh vật ước đoán 100g mẫu nhuyễn thể giá trị MPN nhân với hệ số pha loãng PHỤ LỤC 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỘC TỐ SINH HỌC A PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (ASP) PHẠM VI ÁP DỤNG Hướng dẫn qui định phương pháp xác định hàm lượng ASP mẫu nhuyễn thể mảnh vỏ (dựa theo tài liệu : IOC Manuals and Guides no 33, chapter 7, Wright and Quilliam: “Methods for Domoic Acid, the Amnesic Shellfish Poisons”) Giới hạn phát phương pháp 0.2 mg/Kg NGUYÊN TẮC ASP chiết tách từ mẫu nhuyễn thể hỗn hợp methanol-water (1:1) Hàm lượng ASP dịch chiết mẫu xác định sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò UV THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT DUNG DỊCH 3.1 Thiết bị, dụng cụ: 3.1.1 Máy sắc ký lỏng hiệu cao, gồm phận sau: Bơm pha động (Hitachi L-7100), tiêm mẫu tự động (Hitachi L-7200), điều nhiệt cột (Hitachi L-7300), đầu dò UV- VIS (Hitachi L-7420), điều khiển hệ thống (Hitachi D7000) phần mềm xử lý 3.1.2 Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt m (Merck- Licrocart 250-4 RP18) 3.2 Hóa chất, dung dịch: 3.2.1 Chuẩn Domoic acid (Sigma, P-6152) Bảo quản chuẩn rắn tủ đông 3.2.2 Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước HPLC) 3.2.3 Dung môi: acetonitrile methanol loại dùng cho HPLC 3.2.4 Trifluoroacetic acid (TFA) tinh khiết phân tích 3.2.5 Dung dịch pha động cho máy HPLC: Trộn 150ml ACN (3.2.3) khoảng 800ml nước HPLC (3.2.2) bình định mức 1000ml (3.1.14), thêm 1,0 ml TFA (3.2.4), định mức đến 1L với nước HPLC (3.2.2) Đuổi khí cách đánh siêu âm 15 đến 20 phút bể siêu âm (3.1.5) Bảo quản dung dịch nhiệt độ phòng, sử dụng tuần.3.2.6 Dung dịch chiết mẫu: Trộn Methanol (3.2.3) nước HPLC (3.2.2) theo tỉ lệ thể tích (1:1) Chuẩn bị dung dịch trước lần sử dụng 3.2.7 Dung môi pha chuẩn: Trộn Acetonitril (3.2.3) nước HPLC (3.2.2) theo tỉ lệ thể tích (1:9) Chuẩn bị dung dịch trước lần sử dụng 3.2.8 Dung dịch chuẩn gốc 500g/ml: Cân xác 5,0  0,1 mg cân phân tích(3.1.7) domoic acid (3.2.1) vào bình định mức 10ml, hịa tan chuẩn định mức đến 10ml dung dịch CH3CN 10% (3.2.7), lắc Bảo quản dung dịch tủ lạnh (2-8oC) không sử dụng, đưa nhiệt độ phòng sử dụng Dung dịch dùng tháng 3.2.9 Dung dịch ASP 25g/ml: Hút xác 500l dung dịch chuẩn gốc (3.2.8) vào bình định mức 10ml Thêm dung dịch CH3CN 10 % (3.2.7) đến vạch, lắc Bảo quản tủ lạnh (2 - 8oC), đưa nhiệt độ phòng sử dụng, dung dịch bền tháng 3.2.10 Dung dịch ASP 2,5 g/ml: Hút xác 1000l dung dịch chuẩn ASP 25g/ml (3.2.9) vào bình định mức 10ml Thêm CH3CN 10 % (3.2.7) đến vạch, lắc Bảo quản tủ lạnh (2 - 8oC), đưa nhiệt độ phòng sử dụng, dung dịch bền tháng 3.2.11 Dung dịch ASP 2,0 g/ml: Hút xác 800l dung dịch chuẩn domoic 25g/ml (3.2.9) định mức 10ml Thêm CH3CN 10 % (3.2.7) đến vạch, lắc Bảo quản tủ lạnh (2 - 8oC), đưa nhiệt độ phòng sử dụng, dung dịch bền tháng 3.2.12 Dung dịch ASP 1,0 g/ml: Hút xác 400l dung dịch chuẩn 25 g/ml solution (3.2.9) vào bình định mức 10ml Thêm CH3CN 10 % (3.2.7) đến vạch, lắc Bảo quản tủ lạnh (2 - 8oC) không sử dụng, đưa nhiệt độ phòng sử dụng, dung dịch bền tháng 3.2.13 Dung dịch ASP 0,5g/ml: Hút xác 200l dung dịch chuẩn 25g/ml solution (3.2.9) vào bình định mức 10ml Thêm CH3CN 10 % đến vạch, lắc Bảo quản tủ lạnh (2 – 80C) khơng sử dụng, đưa nhiệt độ phịng sử dụng, dung dịch bền tháng CHUẨN BỊ MẪU 4.1 Chuẩn bị mẫu thô Tách vỏ nhuyễn thể, rửa nước muối Đồng hóa 100g thịt nhuyễn thể máy đồng hoá mẫu (3.1.3) Bảo quản -100C mẫu khơng phân tích khoảng tuần 4.2 Chuẩn bị mẫu thử nghiệm Cân xác 4,0g (m) mẫu đồng hóa (4.1) cân kỹ thuật (3.1.6) vào ống ly tâm (3.1.10) Thử nghiệm lần/mẫu 4.3 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu nhuyễn thể xác định khơng có ASP Chuẩn bị mẫu trắng giống mẫu thử nghiệm 4.4 Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn Mẫu kiểm tra giới hạn phát hiện: đuơc chuẩn bị cách thêm 32L dung dịch chuẩn 25g/mL vào 4,0g mẫu trắng để hàm lượng ASP 0,2mg/Kg Tiến hành phân tích mẫu thử nghiệm Mẫu kiểm soát 4,0mg/kg: đuơc chuẩn bị cách thêm 32L dung dịch chuẩn 500g/mL vào 4,0g mẫu trắng Tiến hành phân tích Mẫu thử nghiệm TIẾN HÀNH THỬ NGHIỆM 5.1 Chiết mẫu làm mẫu: Thêm xác 16,0 ml dung dịch chiết mẫu (3.2.6) vào ống ly tâm chứa mẫu chuẩn bị bước 4.2, (4.3), (4.4) Lắc mẫu 20 phút máy lắc mẫu Ly tâm 4500 vòng/ phút 10 phút máy ly tâm (3.1.4) Lọc dịch qua màng lọc mẫu 0,45m (3.1.11) vào lọ thủy tinh 1,5 ml Xác định hàm lượng ASP dịch chiết máy sắc ký lỏng hiệu cao 5.2 Phân tích mẫu HPLC 5.2.1 Thơng số cài đặt cho HPLC: Pha động: 15% Acotonitrile Tốc độ dịng : 0,8 ml/phút Thể tích tiêm : 20 l Đầu dò UV : 242nm Nhiệt độ cột : 35oC 5.2.2 Thứ tự tiêm mẫu Mẫu trắng Các chuẩn để dựng đường chuẩn Tính Hệ số hồi qui tuyến tính R2 Mẫu kiểm tra giới hạn phát Mẫu kiểm sốt 4mg/Kg Tính diện tích mũi sắc ký thu độ thu hồi Các dịch mẫu thử nghiệm Tính diện tích mũi sắc ký hàm lượng ASP có dịch mẫu thử nghiệm Xác định hàm lượng ASP mẫu thử nghiệm theo điều TÍNH TOÁN KẾT QUẢ Hàm lượng domoic acid (g/g) mẫu thử tính theo cơng thức: X = C * (V1+ V2)/m Trong đó: X: Hàm lượng ASP mẫu kiểm (mg/Kg) C: Hàm lượng ASP tính từ đường chuẩn (g/ml) V1: Thể tích mẫu sử dụng thử nghiệm (ml) V2: Thể tích dung dịch chiết mẫu sử dụng bước (ml) m: Khối lượng mẫu thử nghiệm (g) ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG Mẫu giới hạn phát phải cho tín hiệu tương ứng lần nhiễu Độ sai lệch hai lần tiêm khơng vượt q 5% Hệ số hồi qui tuyến tính: R2  0,99 Độ thu hồi mẫu kiểm soát : 76-91% B PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ (PSP) TRONG THỊT NGHÊU TRÊN HPLC (Phương pháp Thielert cải tiến) Phạm vi áp dụng: Phương pháp áp dụng để xác định hàm lượng PSP thịt nghêu Giới hạn phát phương pháp nằm khoảng ppm (giới hạn PSP cho phép thịt nghêu 80  g/100g) Nguyên tắc: PSP thịt nghêu sau chiết tách pha lỏng với acid acetic 0,03 N, bơm vào HPLC Tại thành phần khác độc tố (STX, NEO, GTX1, GTX2, GTX3 …) phân tách riêng biệt cột LC-18 pha đảo sử dụng phương pháp cặp ion oxi hố sau với periodic acid để tạo dẫn xuất huỳnh quang Các dẫn xuất tạo huỳnh quang nhạy đo dễ dàng với đầu dò huỳnh quang máy HPLC Các độc tố thuộc nhóm PSP B1, B2, C1, C2, C3, C4 xác định so sánh diện tích peak dung dịch chiết có khơng có q trình thủy giải Thiết bị hố chất: 3.1 Thiết bị:  HPLC với đầu dò huỳnh quang  Hệ thống phản ứng sau cột gắn sau cột sắc ký máy HPLC  Cột LC RP 18 (Merck, Supelco, )  Lọc màng 0,45 m  Máy đồng mẫu có tốc độ cao  Cân phân tích  Máy ly tâm 3.2 Hố chất thuốc thử:  Nước cất loại cho HPLC  Acetonitrile loại cho HPLC  Tetrahydrofuran  Octanesulfonic acid  Acid acetic  Acid Cloric  Sodium acetate  Acid periodic  NH3  Dung dịch chuần STX, NEO, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, dcGTX2, dcGTX3, dcSTX (Marine Analytical Chemistry Standard Program, National Research Council Canada, Halifax, NS, Canada) dung dịch pha xác có nồng độ từ – 100  m/ ml  Thịt nghêu chuẩn (hàm lượng PSP mẫu xác nhận): (Marine Analytical Chemistry Standard Program) Chuẩn bị mẫu phân tích Nghêu rửa vỏ bên trước mở vỏ Nhúng nhanh thịt nghêu nước để loại bỏ cát sạn tạp chất khác Khi lấy thịt nghêu khỏi vỏ cần tránh làm hư hại thịt nghêu Cân lượng khoảng 150 g thịt nghêu cho lên rây có cỡ số 5, để yên phút để loại bỏ Thịt nghêu sau nghiền máy nghiền đồng hồn tồn Qui trình chiết độc tố từ thịt nghêu: Cân xác 0,1-1 g mẫu nghêu đồng hoá (bước 4) vào ống ly tâm Thêm 1,0 ml acid acetic 0,03 N Quá trình chiết độc tố qua giai đoạn sau: - Xử lý10 phút bên ULTRASONIC BATH - Ly tâm 10 phút với tốc độ 14.000 vòng /phút - Lọc qua màng lọc 0,45 m - Tiêm vào HPLC Thủy giải độc tố thuộc nhóm N-sulfocarbamoyl : Các độc tố thuộc nhóm N-sulfocarbamoyl thủy giải cách đun nóng150 l dịch chiết bước với 37 l acid HCl 1,0 N 15 phút nhiệt độ 90 độ C Sau làm nguội đến nhiệt độ phịng hỗn hợp trung hồ với 75l CH3COONa 1N tiêm vào HPLC Qui trình phân tích độc tố HPLC + Điều kiện phân tích HPLC:  Cột LC RP 18 (Merck, Supelco, )  Pha động: Pha động 1: 98,5 % (11 mM muối sodium octanesulfonic acid + 40mM phosphorus acid chỉnh pH 6,9 với NH3) 1,5 % tetrahydrofuran Pha động 2: 98,5 % (11 mM muối sodium octanesulfonic acid + 40mM phosphorus acid chỉnh pH 6,9 với NH3) 15,0 % acetonitrile 1,5 % tetrahydrofuran Pha động 3: 98,5 % 40mM phosphorus acid chỉnh pH 6,9 với NH3 1,5 % tetrahydrofuran  Chế độ gradient: Thời gian (phút) Pha động (%) Pha động (%) Pha động (%) 50 50 10 50 50 12 100 35 100 36 100 0 47 100 0 48 50 50 57 50 50 Tốc độ dịng: 1,2 ml/phút Thể tích bơm: 10 l Bước sóng cài đặt: Ex: 330 nm Em: 395 nm Tạo dẫn xuất huỳnh quang phương pháp post column: - Tác nhân oxi hoá: 10mM periodic acid 550mM NH3 Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút - Phản ứng: 50 độ C ống thể tích teflon 1ml - Tác nhân acid hố: M acetic acid Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút + Bơm dung dịch PSP chuẩn (nồng độ từ 1-100g/ml vào máy Nếu đường chuẩn có độ tuyến tính tốt qua điểm zero sử dụng đường chuần điểm (thí dụ điểm có nồng độ 10g cho phân tích thường nhật + Bơm dịch chiết vào máy Mỗi dịch chiết bơm lần Tính diện tích trung bình cho dịch chiết + Các dung dịch chuẩn bơm vào máy HPLC sau C ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY – PHƯƠNG PHÁP THỬ SINH HỌC TRÊN CHUỘT (Diarrhetic shellfish poisoning – Mouse bioassay) Phạm vi áp dụng: Hướng dẫn mơ tả qui trình xác định tổng hàm lượng DSP (bao gồm Okadaic acid, Dinophysistoxin, Pectentoxin, Yessoyoxin, Azaspiracds) nhuyễn thể mảnh vỏ, phương pháp thử sinh hóa chuột Thuât ngữ định nghĩa: Diarrhetic shellfish poisoning ( DSP): độc tố gây tiêu chảy Người bị ngộ độc độc tố ăn phải loài nhuyễn thể mảnh vỏ bị nhiễm độc tố, ví dụ như: sị điệp, sị huyết, sị lơng, nghêu v.v…Độc tố DSP tích tụ thịt nhuyễn thể Nguyên tắc: Độc tố thịt nhuyễn thể chiết tách Aceton làm phương pháp lỏng – lỏng với Dichloromethan Loại bỏ hoàn toàn Dichloromethan dịch chiết máy quay chân khơng áp suất thấp Hịa tan cặn ml dung dịch Tween 60, 1% Hàm lượng độc tố dung dịch Tween xác định phương pháp thử sinh hóa chuột Hóa chất thuốc thử: Aceton loại tinh khiết, Dichloromethan, loại tinh khiết phân tích, Tween 600, loại tinh khiết phân tích, Nước cất vơ trùng, Cách pha Tween 600, 1%: Hịa tan hồn tồn Tween 600 vào nước cất vô trùng làm ấm với tỉ lệ 1:99, ta Tween 600, 1% Động vật thí nghiệm: Chuột khỏe mạnh, trọng lượng 19-21g, giống dùng cho thí nghiệm sinh học Khơng sử dụng chuột có trọng lượng > 23g không sử dụng lại chuột qua thử nghiệm Cách tiến hành: 6.1 Chuẩn bị mẫu: 6.1.1 Nghêu, sò trai: Rửa vỏ nhuyễn thể, cắt khép để thực việc tách vỏ, xúc rửa bên nước để làm trơi cát ngoại vật bên ngồi Tại vị trí khớp nối, tách phần thịt khỏi khép Không sử dụng nhiệt chất sát trùng trước tách vỏ, không cắt làm tổn hại đến phần thịt Lấy khoảng 150g thịt nhuyễn thể cho vào đĩa sứ, sau chuyển phần thịt vào rây số 10 để nước phút, loại bỏ nước mảnh vỏ cịn sót Xay mẫu đồng 6.1.2 Sò điệp: Tách phần ăn sò điệp, để nước đồng mục 6.1.1 6.1.3 Nhuyễn thể mảnh vỏ đồ hộp: Đổ phần thịt phần nước vào máy xay Xay đồng mẫu Đối với đồ hộp lớn, làm nước phút rây có đường kính lổ rây từ 8-12 thu hồi toàn dịch mẫu Xác định trọng lượng mẫu khơ thể tích nước thu được, sau xay đồng 6.2 Ly trích: Cân 100g mẫu (tồn thể) vào cốc thủy tinh lít Bổ sung 100ml Acetone, nghiền mẫu cho đồng phút, lọc dịch vào bình cầu cất quay 500ml Lặp lại trình chiết xuất với Acetone lần nữa, lần với 100ml Acetone Lọc dịch vào bình cất quay 500ml Cất quay loại bỏ acetone áp suất thấp nhiệt độ không 40oC Chuyển dịch nước cịn lại sau cất quay vào bình chiết 500ml Thêm 100ml Dichloromethan, đậy nắp bình chiết, lắc mạnh Chuyển lớp dichloromethan vào bình cất quay Thực trình chiết với dichloromethan lần nửa, mổi lần dùng 100ml dung dịch dichloromethan Chuyển lớp dichloromethan vào bình cất quay 500ml Cất quay loại bỏ dichloromethan tới khơ hồn tồn áp suất thấp nhiệt độ khơng q 40oC Hịa tan cặn 4ml dung dịch Tween 600, 1% (1ml dịch Tween thu tương đương với 25g mẫu) 6.3 Thử nghiệm sinh hóa chuột: Chọn chuột có trọng lượng 19-21g Tiêm màng bụng 1ml dịch mẫu Xác định xác thời điểm tiêm, quan sát chuột 24 để xác định thời điểm chuột chết Ghi chép thời điểm chuột chết vào phiếu theo dõi thử nghiệm độc tố (phụ lục 1) Biểu thị kết quả: Kết xác định dương tính (hàm lượng độc tố vượt ngưỡng cho phép), vòng 24 kể từ thời điểm tiêm xong có từ 2-3 nhóm chuột chết Mẫu có kết thử nghiệm dương tính xem khơng thích hợp để làm thức ăn cho người ... đó, đề tài ? ?Nghiên cứu biến động vi sinh vật, độc tố kim loại nặng, thiết lập biện pháp đảm bảo vệ sinh an toàn nguyên liệu nghêu (Meretrix lyrata) Cà Mau? ?? cần thiết, góp phần đẩy mạnh vi? ??c quản... với đề tài ? ?Nghiên cứu biến động vi sinh vật, độc tố kim loại nặng, thiết lập biện pháp đảm bảo vệ sinh an toàn nguyên liệu nghêu (Meretrix lyrata) Cà Mau? ?? cần thiết, góp phần đẩy mạnh vi? ??c quản... lượng nghêu nguyên liệu đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu biến động vi sinh vật q trình ni: vi sinh vật tổng số, Fecal coliform, Samonella, Vibrio cholerae, Vibrio