BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG  NGUYỄN PHƯỚC BẢO HOÀNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE KỸ THUẬT TỪ XẠ KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘT RONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60. 54. 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS TRẦN THỊ LUYẾN Khánh Hòa - 2012 ương nghiên cứu Trang i i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này Trước hết tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến GS.TS Trần Thị Luyến đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa luận văn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành cuốn luận văn này. Đồng thời, tôi cũng gửi xin cảm ơn quý Thầy, Cô trong Hội đồng bảo vệ đề cương thạc sĩ đã có những ý kiến đóng góp, lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Xin gửi lời cảm ơn quý Thầy Cô Viện công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng thí nghiệm Viện CNSH và Bộ môn Hóa - Vi sinh, Khoa Chế Biến, Trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của bản thân đến gia đình vì tình yêu thương, đã luôn ở bên cạnh động viên và ủng hộ trong suốt quá trình học cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này! Xin trân trọng cảm ơn! Khánh Hòa, tháng 01 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Phước Bảo Hoàng ương nghiên cứu Trang ii ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Trần Thị Luyến. Các số liệu và kết quả nghiên cứu được nêu trong luận văn là trung thực, có trích dẫn nguồn gốc rõ ràng và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác. Khánh Hòa, tháng 03 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Phước Bảo Hoàng ương nghiên cứu Trang iii iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 4 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 4 1.1.2. Cấu tạo và đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 5 1.1.3. Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn 7 1.1.4. Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora 8 1.2. Tổng quan enzyme cellulase 10 1.2.1. Cơ chất của enzyme cellulase 10 1.2.2. Phức hệ enzyme cellulase phân cắt cellulose 15 1.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 24 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase 29 1.3.1. Lược sử nghiên cứu cellulase trên thế giới và trong nước 29 1.3.2. Các lĩnh vực ứng dụng cellulase 32 1.4. Rong Mứt 36 1.4.1. Giới thiệu chung 36 1.4.2. Hệ thống và đặc điểm phân loại rong Mứt 36 1.4.3. Tình hình chế biến và sử dụng thực phẩm được từ rong biển tại Việt Nam 39 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1. Đối tượng và hóa chất 43 2.1.1. Đối tượng 43 2.1.2. Hóa chất và thiết bị chuyên dụng 44 ương nghiên cứu Trang iv iv 2.2. Phương pháp nghiên cứu 48 2.2.1. Phương pháp hóa sinh 48 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 49 2.2.3. Phương pháp đánh giá phân tích 50 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 51 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính 51 2.3.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase 51 2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh enzyme 54 2.4. Bố trí thí nghiệm thu nhận C-CPE từ dịch nuôi cấy 57 2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa 57 2.4.2. Lựa chọn nồng độ kết tủa 58 2.4.3. Xác định tính chất lý hóa của C-CPE 58 2.5. Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis 59 2.6. Phương pháp xử lý số liệu 64 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65 3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao 65 3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp 65 3.1.2. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 67 3.2. Xác định các điều kiện môi trường tối ưu sinh tổng hợp cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 72 3.2.1. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian 72 3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 74 3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nguồn carbon 76 3.2.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitrogen 79 3.2.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 82 3.2.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu 83 3.2.7. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme celluase có hoạt tính cao nhất theo quy hoạch Box – Behnken. 85 ương nghiên cứu Trang v v 3.3. Nghiên cứu tách chiết và xác định một số đặc tính của cellulase của Micromonospora VTCC-A-1787 91 3.3.1. Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân kết tủa C-DC 91 3.3.2. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ tác nhân kết tủa 93 3.3.3. Nghiên cứu tính chất lý hóa của C-CPE cellulase 94 3.4. Đề xuất quy trình thu chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ chủng xạ khuẩn chi Micromonospora VTCC-A-1787 95 3.5. Nghiên cứu sản xuất bột rong thực phẩm 96 3.5.1. Kết quả nghiên cứu xác định các thành phần chủ yếu trong rong Mứt Porphyra Vietnamensis 97 3.5.2. Kết quả nghiên cứu sử dụng C-CPE của chủng Micromonospora VTCC-A- 1787 trong quá trình thủy phân 98 3.5.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng bột rong 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101 Kết luận 101 Kiến nghị 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC 106 Phụ lục 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH 106 Phụ lục 2. BẢNG KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM 111 Phụ lục 3. MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG 114 Phụ lục 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 116 ương nghiên cứu Trang vi vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose của các loại thực vật 13 Bảng 1.2. Phân nhóm VSV theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau 25 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng trong 100g rong Mứt 39 Bảng 2.1. Nhóm xạ khuẩn chi Micromonospora-VTCC 43 Bảng 2.2. Thành phần hóa học môi trường nuôi cấy 45 Bảng 2.3. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 47 Bảng 3.1. Định tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày 65 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày 67 Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm sinh lý hóa Micromonospora VTCC-A-1787 68 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 77 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 80 Bảng 3.6. Các nhân tố và khoảng biến thiên của quy hoạch thực nghiệm 86 Bảng 3.7. Các kết quả thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm 86 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa khác nhau đên C-CPE cellulase Micromonospora VTCC-A-1787 92 Bảng 3.9. Thành phần hóa học trong rong Porphyra vietnamensis khô 97 Bảng 3.10. Kết quả của quá trình thủy phân rong Mứt bằng C-CPE 98 Bảng 3.11. Trạng thái cảm quan của bột rong thủy phân 99 Bảng 3.12. Thành phần dinh dưỡng cơ bản của bột rong 99 Bảng 3.13. Kết quả kiểm nghiệm vi sinh vật bột rong thủy phân 100 ương nghiên cứu Trang vii vii DANH MỤC HÌNH Hình 1-1. Cấu trúc của xạ khuẩn 5 Hình 1-2. Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật 11 Hình 1-3. Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử cellulose (b) 11 Hình 1-4. Liên kết β-1,4 glucoside trong mạch cellulose 12 Hình 1-5. Liên kết hydro giữa các sợi cellulose 12 Hình 1-6. Cơ chế hoạt động của Exo-glucanase 16 Hình 1-7. Cơ chế hoạt động của Endoglucanase 16 Hình 1-8. Cơ chế hoạt động của β-glucosidase 17 Hình 1-9. Mô hình phân hủy cellulose tinh thể 17 Hình 1-10. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cellulose 19 Hình 1-11. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 20 Hình 1-12. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) 21 Hình 1-13. Các loại rong Mứt phổ biến tại Việt Nam 37 Hình 2-1. Các chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC 43 Hình 2-2. Hình dáng rong Mứt Porphyra vietnamensis 44 Hình 2-3. Rong Mứt Porphyra vietnamensis tươi 44 Hình 2-4. Các nguyên liệu bổ sung vào môi trường nuôi cấy 45 Hình 2-5. Quá trình định tính cellulase 48 Hình 2-6. Đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu 49 Hình 2.7. Mẫu rong mứt tươi Porphyra vietnamensis 61 Hình 2.8. Mẫu rong Mứt Porphyra vietnamensis khô sau khi xử lý 61 Hình 2.9. Mẫu rong ngâm xử lý CH 3 COOH 1% 62 Hình 2.10. Bột rong Mứt nguyên liệu 63 Hình 3-1. Vòng phân giải cơ chất của chủng Micromonospora sau 3 ngày 66 Hình 3-2. Khuẩn lạc Micromonospora VTCC-A-1787 67 Hình 3-3. Khả năng lên men đường của Micromonospora VTCC-A-1787 68 Hình 3-4. Đường cong sinh trưởng của Micromonospora VTCC-A-1787 69 Hình 3-5. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 71 ương nghiên cứu Trang viii viii Hình 3-6. Vòng phân giải cơ chất CMC theo thời gian 72 Hình 3-7. Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 73 Hình 3-8. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất CMC đến kích thước vòng phân giải 74 Hình 3-9. Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 75 Hình 3-10. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến vòng phân giải CMC 76 Hình 3-11. Ảnh hưởng của nồng độ bã mía đến hoạt tính enzyme cellulase của chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 78 Hình 3-12. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến vòng phân giải CMC 80 Hình 3-13. Ảnh hưởng của nồng độ bột cá đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 81 Hình 3-14. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến vòng phân giải cơ chất 82 Hình 3-15. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 83 Hình 3-16. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến vòng phân giải cơ chất CMC 84 Hình 3-17 . Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả năng tổng hợp enzyme chủng MicromonosporaVTCC-A- 1787 84 Hình 3-18a. Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzyme ở nồng độ pH 6,5 với nhiệt độ và thời gian nuôi cấy ở dạng 3D 87 Hình 3-18b. Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzymepH 6,5 với nhiệt độ và thời gian nuôi cấy dạng mặt phẳng 88 Hình 3-19a. Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzyme ở thời gian là 132 giờ với pH và thời gian nuôi cấy ở dạng 3D. 88 Hình 3-19b. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở thời gian là 132 giờ với pH và nhiệt độ ở dạng mặt phẳng 89 Hình 3-20a. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzymeở nhiệt đô 32,5 0 C với pH và thời gian ở dạng 3D 89 ương nghiên cứu Trang ix ix Hình 3-20b. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở nhiệt đô 32,5 0 C với pH và thời gian ở dạng mặt phẳng 90 Hình 3-21. C-DC cellulase của Micromonospora VTCC-A-1787 91 Hình 3-22. Vòng phân giải cơ chất CMC của C-DC cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 theo quy trình tối ưu 91 Hình 3-23. Kết quả đường kính thủy phân trước và sau khi kết tủa 92 Hình 3-24. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt độ enzyme 93 Hình 3-25. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme 94 Hình 3-26. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme 95 [...]... nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzyme hoạt tính cao có nguồn gốc tự nhiên, tiếp tục nghiên cứu để sản xuất được cellulase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu thị trường và các loại thực phẩm có các thành phần chứa hoạt tính sinh học nhằm gia tăng giá trị rong biển Việt Nam, đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase kỹ thu t từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột rong thực phẩm là... hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao - Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu nhận dịch chiết và chế phẩm enzyme kỹ thu t ở quy mô phòng thí nghiệm - Bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme trên thủy phân rong mứt sản xuất bột rong thực phẩm và đánh giá chất lượng của bột rong này 4 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần thêm những hiểu biết về đặc tính enzyme cellulase. .. cần thiết 2 Mục đích nghiên cứu của đề tài Thăm dò các điều kiện thích hợp để khai thác và thu nhận dịch chiết và chế phẩm enzyme kỹ thu t từ XK chi Micromonospora Sau đó sử dụng C-CPE này thủy phân rong Porphyra Việt Nam để sản xuất bột rong thực phẩm 2 ương nghiên cứu Trang 3 3 Nội dung nghiên cứu của đề tài - Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora thích hợp và nghiên cứu ảnh hưởng của một... cellulase sản xuất từ XK được phân lập tại Việt Nam và ứng dụng của enzyme này trong chế biến thực phẩm - Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ thu t, bổ sung vào các tài liệu phục vụ cho giảng dạy ngành Công nghệ Thực phẩm, ngành Công nghệ sinh học 5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Bước đầu nghiên cứu sử dụng enzyme chiết rút từ XK Micromonospora để thủy phân rong biển và thu. .. và thu chế phẩm là bột rong Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của enzyme cellulase VSV Từ đó cải thiện, nâng cao chất lượng và góp phần tìm ra hướng giải quyết mới mang lại hiệu quả kinh tế cho enzyme sản xuất từ VSV Việt Nam và cho rong biển Việt Nam 3 ương nghiên cứu Trang 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn 1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự... trường nghiêm trọng [17] Trong sản xuất và đời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng được sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế giới tăng 20÷30% mỗi năm Enzyme và những chế phẩm có liên quan được sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá... cơ chế tác dụng và điều kiện hoạt động Vì vậy mà tuỳ thu c vào loại sản phẩm, các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất mà người ta chọn nguồn thu nhận thích hợp Enzyme cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: - Động vật: Thu c nhóm thân mềm, lợn, gà - Thực vật: Mầm của các hạt ngũ cốc như đại mạch, yến mạch, lúa mì 21 ương nghiên cứu Trang 22 - Vi sinh vật: Các loại xạ khuẩn, ... niger) và xạ khuẩn (Actinomycetes) Trong những năm gần đây, nhóm XK đang được các nhà sinh vật thế giới quan tâm nghiên cứu dùng để sản xuất kháng sinh và enzyme gồm 2 chi là Streptomyces và Micromonospora Việc hướng đến sử dụng chế phẩm từ VSV trong sản xuất thực phẩm ngày nay ngày càng rộng rãi, đây là một hướng đi mới tất yếu và hiệu quả trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống bằng phương pháp... phân 1.2.2.3 Cơ chế xúc tác của enzyme cellulase Theo các tài liệu nghiên cứu thì cơ chế xúc tác của hệ enzyme celluase có nhiều kiểu tác động khác nhau Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động hiệp đồng của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau thu phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng... rong biển là nguồn thực phẩm tự nhiên quý giá giàu chất dinh dưỡng, có tác dụng đến sức khỏe và sự ổn định của cơ thể con người Hiện nay, nhu cầu sử dụng rong biển làm thực phẩm trên thế giới ngày càng tăng và phổ biến Tuy nhiên vấn đề khai thác và chế biến rong biển ở Việt Nam còn nhiều mới mẻ và hạn chế, không sử dụng hết sản lượng cũng như hiệu quả lợi ích mà rong đem lại Hơn nữa, các sản phẩm từ . trị rong biển Việt Nam, đề tài: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase kỹ thu t từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột rong thực phẩm là cần thiết. 2. Mục đích nghiên cứu. VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG  NGUYỄN PHƯỚC BẢO HOÀNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE KỸ THU T TỪ XẠ KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘT RONG THỰC PHẨM. - Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu nhận dịch chiết và chế phẩm enzyme kỹ thu t ở quy mô phòng thí nghiệm. - Bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme trên thủy phân rong mứt sản xuất