LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi đến thầy: TS. Lê Lập - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Bác sỹ Lê Đình Hải và KS. Lưu Thị Nguyệt Minh - Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cảm ơn ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cùng toàn thể các cô chú, anh chị trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng và tập thể cán bộ công nhân viên của Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện và động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Nha Trang, tháng 06, năm 2011 Sinh viên Mai Thị Ly Na GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Ở Việt Nam 5 1.2. Vi khuẩn C. perfringens [10] 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái 6 1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học 7 1.2.3. Đặc tính di truyền 8 1.2.4. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens 9 1.2.5. Phân loại các type độc tố của C. perfringens [14] 9 1.3. Những hiểu biết về gene 16S RNA 13 1.3.1. Giới thiệu rRNA (RNA ribosome) 13 1.3.2. Cấu trúc và chức năng của 16S RNA 15 1.4. Phản ứng PCR [2], [9], [37], [38] 16 1.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR 17 1.4.2. Các điều kiện của phản ứng PCR 17 1.4.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR 21 1.4.4. Các hạn chế của phản ứng PCR 22 1.5. Điện di - Phát hiện sản phẩm PCR [2], [9] 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27 2.3. Vật liệu nghiên cứu 27 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 27 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội ii 2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu 27 2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học 28 2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens 29 2.4.4. Xác định đặc tính hình thái của C. perfringens 30 2.4.5. Phương pháp giữ giống vi khuẩn 31 2.4.6. Giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR 31 2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR (Songer J.G. và cộng sự, 1999). 34 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens 37 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens 38 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens 39 3.2.1. Hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn 39 3.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động của C. perfringens 40 3.3. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens 40 3.4. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR 45 3.5. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C. perfringens Clostridium perfringens E. coli Escherichia coli S. agalactiae Streptococus agalactiae Taq Thermus aquaticus BHI Brain Heart Broth SPS Agar Perfringens Selective Agar TSC Agar Tryptose - Sulfit - Cycloserin Agar PCR Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxynucleotide Triphosphate TBE Tris Boric EDTA DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid M Marker - Thang chuẩn DNA Cpa Gene mã hóa Clostridium perfringens Alpha toxin Cpb Gene mã hóa Clostridium perfringens Beta toxin Ext Gene mã hóa Clostridium perfringens Epsilon toxin Itx Gene mã hóa Clostridium perfringens Iota toxin Cpe Gene mã hóa Clostridium perfringens Enterotoxin S Hệ số lắng (Svedberg) Tm Nhiệt độ nóng chảy của một trình tự DNA GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens 10 Bảng 1.2. Các type độc tố gây bệnh của C. perfringens 13 Bảng 1.3. Các loại enzyme polymerases cho phản ứng PCR 18 Bảng 2.1. Các thành phần của phản ứng PCR 33 Bảng 2.2. Nội dung các bước tiến hành chạy PCR 33 Bảng 2.3. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR 35 Bảng 2.4. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR 36 Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens ở mẫu phân và mẫu manh tràng của gà 37 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens.44 Bảng 3.3. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA 46 Bảng 3.4. Kết quả định type độc tố các chủng vi khuẩn C. perfringens 47 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn C. perfringens 4 Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta 6 Hình 1.3. Cấu trúc RNA ribosome 14 Hình 1.4. Cấu trúc bậc 2 của 16S RNA 15 Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR 21 Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32 Hình 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng Multiplex PCR 35 Hình 3.1. Hình thái của vi khuẩn C. perfringens 39 Hình 3.2. Vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi 40 Hình 3.3. Vi khuẩn trên môi trường Fluid Thioglycolate 40 Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS agar 41 Hình 3.5. Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 41 Hình 3.6. Khuẩn lạc trên môi trường Egg yolk 42 Hình 3.7. Phản ứng CAMP test 42 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra lên men đường 43 Hình 3.9. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA 45 Hình 3.10. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringen 47 GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội 1 LỜI NÓI ĐẦU Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, thường thấy trong đất, nước và chất thải. Vi khuẩn cũng thường cư trú tự nhiên trong đường tiêu hóa của các loài gia súc, gia cầm như dê cừu, trâu bò, heo, gà Chúng là nguyên nhân gây nhiễm độc máu, viêm ruột tiêu chảy, hoại thư sinh hơi và gây ngộ độc thực phẩm cho người. C. perfringens là nguyên nhân gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Đây là loại bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra đột ngột với tỷ lệ chết rất cao. Theo Ilenia Drigo (2008), nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủ yếu là do vi khuẩn C. perfringens type A và type C. Trong đó, độc tố alpha đóng vai trò chủ đạo [18]. Tuy nhiên, McDougald (2003) thì lại cho rằng bệnh viêm ruột hoại tử thường kế phát từ bệnh cầu trùng. Theo ông, khi thời tiết hoặc khẩu phần ăn thay đổi đột ngột sẽ làm giảm sức đề kháng của con vật, tạo điều kiện cho cầu trùng gây bệnh. Đây là thời điểm tốt nhất để C. perfringens sinh sôi nẩy nở và sản sinh độc tố gây bệnh. Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ gia đình và các trang trại chăn nuôi có thể lên đến 5 - 50 %. Để xác định loài vi khuẩn C. perfringens trong các mẫu thực phẩm hay mẫu bệnh phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp thường quy phân lập và giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn (Quinn và cộng sự, 1994). Ưu điểm của phương pháp này là tách được các chủng vi khuẩn thuần khiết nhưng lại tốn nhiều thời gian và kết quả không thực sự chính xác do trong quá trình nuôi cấy một số vi khuẩn có thể thay đổi đặc tính sinh hóa. Khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là sinh học phân tử ngày càng phát triển, các phương pháp thử nhanh (PCR, ELISA…) ra đời giúp rút ngắn thời gian phát hiện, định lượng và định danh vi sinh vật với độ chuẩn xác cao. Hiện nay, sử dụng phương pháp PCR trong việc giám định vi khuẩn C. perfringens bằng phát hiện gene 16S RNA ngày càng ứng dụng rộng rãi. Gene 16S RNA là RNA đơn vị nhỏ (small unit) của ribosome vi khuẩn. Ở vi khuẩn, ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein với hệ số lắng S lần lượt là 50S và 30S. Tiểu đơn vị lớn 50S chứa hai loại RNA là 23S rRNA và 5S rRNA, GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội 2 tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ gồm một loại 16S rRNA. Gene 16S rRNA có một đặc điểm rất đặc biệt, đó là chúng mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với những vùng biến động nhưng lại bảo tồn ở cấp độ loài, có trình tự rất bảo thủ không thay đổi qua thời đại và rất chuyên biệt cho mỗi loại vi khuẩn. Chính vì vậy, gene này đã trở thành “một thước đo tiến hóa”, là sự lựa chọn hàng đầu của các nhà khoa học trong việc định danh và phân loại các vi khuẩn [7, 9, 20]. Từ những thực tế trên đây, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Giám định loài và định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử”. Mục tiêu của đề tài : Phát hiện nhanh vi khuẩn C. perfringens, từ đó đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả cho gà và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C. perfringens gây ra. Nội dung của đề tài: 1) Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ gà theo phương pháp thường quy. 2) Giám định loài vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR. 3) Định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn để báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 1.1.1. Trên thế giới Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về C. perfringens gây bệnh cho người và các loại gia súc, gia cầm. Theo Long J. R (1973), bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) do C. perfringens gây ra ở gà được biết đến lần đầu tiên vào năm 1961 trên gà trống non 6 - 7 tuần tuổi tại Anh, sau đó bệnh xuất hiện ở Úc, Canada, Mỹ và Thụy Điển. Bệnh thường xảy ra trên gà từ 2 - 4 tuần tuổi [23]. Hofshagen và cộng sự (1992), đã tiến hành phân lập vi khuẩn C. perfringens từ 192 mẫu phân của 99 con gà thịt và 93 con gà rừng. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phân lập vi khuẩn C. perfringens và khả năng sản sinh độc tố alpha ở gà thịt cao gấp 1,7 lần so với gà rừng [17]. Năm 2004, Hakan Kalender, Viện nghiên cứu và kiểm soát thú y, ElazÝÛ- Thổ Nhĩ Kỳ, đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn C. perfringens từ manh tràng gà và phát hiện gene mã hóa độc tố alpha do vi khuẩn này gây ra bằng phản ứng PCR. Kết quả của nghiên cứu này là tác giả đã phân lập được vi khuẩn C. perfringens từ 8 mẫu manh tràng gà trong số 160 mẫu đem phân tích (5%). Và trong 8 mẫu phân lập được, sau khi tiến hành phản ứng PCR, có 6 mẫu mang gene độc tố type A và 2 mẫu còn lại không thể định type [16]. Effat và cộng sự (2007) đã phân lập vi khuẩn C. perfringens từ các mẫu gà bị bệnh tại các trang trại gà ở Cario - Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử. Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh viêm ruột hoại tử ở các trang trại này [15]. Cũng trong năm 2007, I. Svodosová và cộng sự, Đại học Brno - Cộng hòa Séc đã phân lập 609 mẫu manh tràng của những con gà thịt từ 23 trang trại. Kết quả là tác giả thu được 112 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens (chiếm 18,39%). GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Mai Thị Ly Na TS. Vũ Ngọc Bội 4 Thực hiện phản ứng Multiplex PCR để định type độc tố của vi khuẩn, tác giả xác định tất cả vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều thuộc type A. Trong đó có 4 chủng mang gene cpb2 mã hóa độc tố beta 2 [19]. Rocio Crespo và cộng sự (2007) đã tiến hành so sánh 31 mẫu gia cầm (gà, gà tây, chim cút và vẹt) bị viêm ruột hoại tử từ năm 1997 và 2005 với 19 mẫu gia cầm không có triệu chứng về bệnh này. Qua nghiên cứu cho thấy, tất cả các chủng C. perfringens phân lập từ các gia cầm này đều thuộc type A. Tuy nhiên, trong số đó chỉ có 54% sản sinh độc tố trong ống nghiệm khi phân tích bằng kỹ thuật Western Blot. Và đáng ngạc nhiên là một lượng lớn các chủng vi khuẩn phân lập từ gia cầm khỏe mạnh (90%) có khả năng sản sinh cpb2, trong khi đó hơn một nửa các chủng vi khuẩn phân lập từ gia cầm bị bệnh lại không thể sản sinh loại độc tố này. Từ những điều tra này, tác giả kết luận rằng không có mối liên hệ nào giữa độc tố β2 và bệnh viêm ruột hoại tử ở gia cầm [27]. Theo Ilenia Drigo và cộng sự (2008), với nghiên cứu về các gene độc tố của các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ những con gà khỏe mạnh và gà bị bệnh. Tác giả cho rằng: Type A và type C là hai type độc tố gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà [18]. Năm 2008, TS. Anthony Keyburn, Nghiên cứu sinh của Đại học Monash và cộng sự đã có phát hiện đột phá rằng độc tố alpha không phải là yếu tố chính gây bệnh viêm ruột hoại tử trên gà, ông phát hiện ra một loại độc tố mới NetB mới là yếu tố độc lực chính. Đến nay, ông và nhóm cộng sự đang tiếp tục nghiên cứu để tìm ra một loại vắc-xin thực sự có hiệu quả để chống lại căn bệnh này [12]. Năm 2009, Leen Timbermont và cộng sự đã phân lập được 26 chủng C. perfringens từ gà khỏe mạnh và 24 chủng C. perfringens từ gà nghi bệnh viêm ruột hoại tử. Tiến hành đem nuôi trong ống nghiệm và nhận thấy rằng một tỷ lệ lớn (55 - 67%) chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà nghi bệnh có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh. Vì vậy, tác giả đã đưa ra kết luận: vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà bệnh có khả năng sản sinh độc tố có hoạt lực mạnh hơn vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh [22]. [...]... iota) người ta phân chia vi khuẩn C perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E) Trong đó, type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha và iota Bảng 1.1 Các type độc tố của vi khuẩn C perfringens C perfringens Độc tố chủ yếu Type Alpha Beta... Phương pháp phân lập vi khuẩn C perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học Chúng tôi áp dụng phương pháp thường quy phân lập của Quinn và cộng sự (1994) [26]  Quy trình phân lập Mẫu Phân lập C perfringens Fluid Thiogly - colate Môi trường đặc hiệu (SPS agar) Chọn khuẩn lạc đen tăng sinh trên môi trường thạch máu Xác định các đặc tính sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn Định type vi khuẩn GVHD:... kỹ thuật Multiplex PCR Tác giả cho biết, những chủng vi khuẩn phân lập từ phân đều thuộc type A, mang gene cpa mã hóa sản sinh độc tố alpha; những chủng phân lập từ phủ tạng của dê, cừu bị bệnh vi m ruột hoại tử lại thuộc type D, mang gene cpa và etx [6] Theo nghiên cứu của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009), các chủng vi khuẩn C perfringens mang đầy đủ các đặc tính sinh học của loài, sản sinh độc tố. .. của vi c định type bằng Multiplex PCR cho thấy các chủng C perfringens phân lập từ bò thuộc type A (48,1%) và type D (51,9%); các chủng phân lập từ lợn thuộc type A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta 2 (18,9%) [5] 1.2 Vi khuẩn C perfringens [10] C perfringens phân bố rộng khắp trong môi trường đất, nước, không khí và thường được tìm thấy trong ruột động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi thì vi khuẩn. .. tra vi khuẩn học các mẫu phân lấy từ các động vật trâu bò, cừu, lợn và gia cầm có thể phát hiện được C perfringens Nhóm tác giả cũng nhận thấy vi khuẩn này có thể dễ dàng tìm thấy trong thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, môi trường xung quanh chuồng trại gia súc, trong đất và nguồn nước [2] Theo TS Lê Lập và cộng sự (2007), khi phân lập và xác định type độc tố của vi khuẩn C perfringens ở động vật nhai lại bằng. .. cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của động vật Eukaryote, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận Độc tố gây hoại tử và gây chết Epsilon toxin được tạo ra bởi vi khuẩn C perfringens type B và type D Nó là một protein gồm 311 acid amin với trọng lượng phân tử là 34,25 kDa Loại độc tố này chủ yếu ảnh hưởng đến ruột bằng vi c tăng tính thấm của thành mạch Do đó, tăng cường sự hấp thu độc tố và. .. lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân chính gây bệnh 1.2.5 Phân loại các type độc tố của C perfringens [14] Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố khác nhau như: độc tố alpha (α), beta (β), epsilon (ε), iota (i), beta 2, enterotoxin, theta, vv… Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, GVHD: TS Lê Lập TS Vũ... biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia) Sau khi độc tố được gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào Độc tố làm tăng tính thấm của mao mạch và tác động lên màng tế bào Độc tố này được tạo ra bởi vi khuẩn C perfringens type E Ia và Ib được phân cách bởi điểm đẳng điện Ia có pH đẳng điện là 5,2; khối lượng phân tử 47,5 kDa Và Ib có pH đẳng điện... con và ngựa Độc tố thường gây triệu chứng tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy tự nhiên Enterotoxin là độc tố được mô tả nhiều nhất khi nói đến C perfringens, có tác động đến tế bào biểu mô và gây bệnh về đường ruột Độc tố gây tiêu chảy làm mất nước và chất điện giải trong cơ thể Enterotoxin được sản sinh trong quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn và độc tố sẽ tăng khi tế bào sinh. .. Lê Lập TS Vũ Ngọc Bội 5 SVTH: Mai Thị Ly Na Saad Gharaibeh và cộng sự (2010) đã phân lập được 67 chủng vi khuẩn C perfringens từ 155 mẫu phân gà thịt nuôi tại Jordan (chiếm 43,2%) Thực hiện phản ứng Multiplex PCR thì nhận thấy 100% các chủng vi khuẩn C perfringens đều thuộc type A Tác giả cũng tiến hành kiểm tra sự mẫn cảm của 67 chủng vi khuẩn C perfringens với kháng sinh và kết quả cho thấy C perfringens . trường - Trường Đại học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: Giám định loài và định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử . Mục tiêu của. giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR 45 3.5. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được bằng kỹ thuật. độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha và iota. Bảng 1.1. Các type