i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VI Ệ N V Ệ SINH D Ị CH T Ễ TRUNG ƯƠNG * HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2014 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG * HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số : 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đặng Đức Anh 2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai HÀ NỘI – 2014 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Vũ Mai Phương iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:  Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.  Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay. Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013 HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG v MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 4 1.1. Vi rút cúm A 4 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A 4 1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A 11 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A 13 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A 15 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm 16 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A 17 1.2. Phòng và điều trị cúm A 18 1.2.1. Văc xin phòng cúm 18 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A 20 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới 23 1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút 25 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine 25 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir 26 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 27 vi 1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc 27 1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm 28 1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase 32 1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm 34 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu 37 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm 38 2.3.1. Vật liệu 38 2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm 42 2.4. Phân tích số liệu 51 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 53 3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 53 3.2. Xác định giá trị IC 50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A 54 3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A 60 3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir 65 3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 69 3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu 72 vii CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN 86 4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu 86 4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC 50 ) 88 4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam 94 4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. 98 KẾT LUẬN 101 KIẾN NGHỊ 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems APHL Association of Public Health Laboratories (Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng) ATSH An Toàn Sinh Học DNA Deoxiribonucleic Acid GISRS Global Influenza Surveillance and Response System (Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu) IC 50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút) IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị) ISIRV-AVG International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút) Kb Kilobase NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase) NIID National Institute of Infectious Diseases - Japan (Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản) PCR Polymerase Chain Reaction pdm Pandemic PTN Phòng Thí Nghiệm RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới US-CDC United States- Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) ix DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A 6 3.1. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu 53 3.2. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC 50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn 56 3.3. Giá trị IC 50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 60 3.4. Giá trị IC 50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011 61 3.5. Giá trị IC 50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 62 3.6. Giá trị IC 50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 62 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir 64 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến 70 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen) 71 x DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc vi rút cúm 4 1.2. Hình ảnh vi rút cúm 4 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm 10 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm 10 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút 12 1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine 21 1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir 22 1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào 23 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen 50 3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 66 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09 67 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 68 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 69 3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 74 3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 – nhóm 2, 2001-2009 75 3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 76 3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009 77 3.9. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 79 3.10. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 80 3.11. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 83 [...]... truyền c a vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc c a vi rút cúm A Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu Tính kháng thuốc oseltamivir c a vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Vi t Nam, 2001 – 2012 với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng c a oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền. .. N9 c a vi rút A/ H11N9, các gen còn lại tương tự vi rút A/ H9N2 [63] Ngoài ra, qua sự trao đổi và tích hợp này, vi rút cúm mới có thể mang gen kháng thuốc từ chủng vi rút cúm khác, điển hình là gen M mang đột biến kháng amantadine c a vi rút H1N1pdm09 và phân đoạn gen mã h a NA mang đột biến kháng oseltamivir c a vi rút H7N9 [30, 63] Như vậy, chủng vi rút mới sẽ có thể là căn nguyên c a đại dịch lan... năm 2001 và chương trình giám sát cúm quốc gia tại Vi t Nam (vi n Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phối hợp với US-CDC từ năm 2006), bệnh cúm ở Vi t Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh rõ rệt vào m a đông xuân với sự lưu hành c a vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và m a hạ với sự lưu hành c a các chủng thuộc phân típ cúm A (tháng 7 – tháng 8) [5] 1.1.6 Tiến h a c a vi rút cúm A Sự tiến h a c a vi rút cúm. .. dụng c a amantadine và rimantadine (Nguồn: http://umanitoba.ca và Drugs discovery approaches – Wiley 2007) Các thuốc kháng vi rút dòng ức chế neuraminidase Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase c a vi rút cúm (Hình 1.7) Neuraminidase phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA c a hạt vi rút mới nảy chồi tại cầu nối đặc hiệu α 2,3Gal-sialic... lưu hành (amantadine, oseltamivir ) được sử dụng trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút, đặc biệt là vi rút A/ H5N1 Tuy vậy, một trong những tương tác c a thuốc với vi rút là hiện tượng đột biến xuất hiện trong vật liệu di truyền c a vi rút và hệ quả là sự kháng thuốc c a vi rút ở thế hệ sau [56, 58, 67] 1.3.1 Tình hình kháng thuốc c a vi rút cúm với thuốc amantadine Amantadine và rimantadine là các... miền Bắc Vi t Nam - Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50) 3 - Đánh giá sự tương đồng về di truyền học gi a các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Vi t Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001- 2012 4 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1 Vi rút cúm A 1.1.1 Cấu tạo chung và hệ gen c a vi. .. polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein) Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA c a vi rút tạo thành nucleocapsid Tồn tại trong thành phần c a vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA và các protein không cấu trúc NS (non structure) Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng c a vi rút cúm A Hệ gen c a vi rút cúm A Vi rút cúm. .. bào nhờ hoạt động c a neuraminidase (Hình 1.5) Hình 1.5 Cơ chế nhân lên c a vi rút và cơ chế tác dụng c a thuốc kháng vi rút Nguồn: Nature Review – Drug Discovery 13 1.1.3 Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen c a vi rút cúm A Những thay đổi nhỏ trên gen Polymerase c a vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức năng s a ch a sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên... mức độ kháng thuốc c a vi rút tăng gấp 1000 lần so với chủng vi rút nhạy cảm [40] Các phương pháp xác định nồng độ oseltamivir bị kháng bởi vi rút đã và đang được tiến hành với mục đích xác định chính xác mức độ kháng c a vi rút với thuốc [40, 41] Hình 1.7 Cấu trúc c a oseltamivir và zanamivir (Nguồn: http://umanitoba.ca ) 23 Hình 1.8 Cơ chế hoạt động c a neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong... chất c a tế bào chủ Sự tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng c a vi rút Khác với các vi rút mang RNA sợi đơn âm, RNA c a vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào Các RNP được chuyển vào nhân tế bào, phức hợp polymerase gắn vào RNA c a vi rút, đồng thời cắt mRNA c a tế bào chủ bằng hoạt động c a nuclease nội bào Nuclease nội bào c a vi rút cắt đầu 5’ đã được gắn mũ và metyl h a c a mRNA . Tính kháng thuốc oseltamivir c a vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Vi t Nam, 2001 – 2012 với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng c a oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC 50 ) vi rút cúm. các vi rút cúm A 60 3.4. Vị trí đột biến trên protein NA c a các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir 65 3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Vi t Nam,. quan c a các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc oseltamivir c a các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Vi t Nam 94 4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học c a các chủng vi rút A mang