i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của tập thể các thầy cô hướng dẫn, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này em xin chân thành bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới: Toàn thể thầy cô, cán bộ thuộc Viện Công nghệ sinh học và môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt 4 năm học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời. Thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và môi trường và cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Ban quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, phòng thực hành Hóa sinh – Vi sinh, Khoa Chế biến đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. Em xin cảm ơn những người bạn của em không những động viên mà còn cùng đồng hành, sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài. Con cảm ơn bố mẹ đã luôn âm thầm cổ vũ, ủng hộ cho con và là nguồn động viên lớn nhất mỗi khi con cảm thấy khó khăn nhất. Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý. Nha trang, ngày 02 tháng 07 năm 2012 Sinh viên thực tập Ngô Yến Thủy ii MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1 TỔNG QUAN PHẾ LIỆU TÔM 3 1.1.1 Khái quát về phế liệu tôm 3 1.1.2 Thành phần và tính chất của phế liệu tôm 4 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITIN 5 1.2.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 5 1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin 6 1.2.3 Tính chất của chitin 7 1.2.4 Ứng dụng của chitin và dẫn xuất của chitin 7 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHITIN 8 1.3.1 Sản xuất chitin theo phương pháp hóa học [10] 8 1.3.2 Sản xuất chitin theo phương pháp sinh học 11 1.3.3 Sản xuất chitin kết hợp phương pháp sinh học với phương pháp hóa học 14 1.4 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP MẶT ĐÁP ỨNG 17 1.4.1 Giới thiệu 17 1.4.2 Nguyên lý 17 1.4.3 Ứng dụng 18 1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 18 1.5.1 Khái quát về enzyme 18 1.5.2 Cơ chế tác dụng của enzyme. 19 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân bằng enzyme 21 1.5.4 Enzyme Alcalase 23 CHƯƠNG II: 24 iii NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24 2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 24 2.1.2 Enzyme Alcalase 24 2.1.3 Hóa chất 24 2.1.4 Thiết bị 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 24 2.2.2 Bố trí thí nghiệm tổng quát 25 2.2.3 Xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 26 2.2.4 Xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme 27 2.2.5 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein bằng Alcalase 28 2.2.6 Bố trí thí nghiệm tối ưu quy trình khử protein bằng Alcalase 31 2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH. 33 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 33 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 34 3.2 Ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme 35 3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein 37 3.4 Tối ưu công đoạn tách protein của đầu tôm bằng Alcalase 42 3.5 ĐỀ SUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ SUẤT Ý KIẾN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 55 iv DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Diễn giải AU Đơn vị hoạt độ enzyme thủy phân protein DD Độ deacetyl hóa DH Độ thủy phân E/S Tỷ lệ enzyme/cơ chất RSM Phương pháp mặt đáp ứng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần (%) đầu và vỏ phế liệu tôm 3 Bảng 2.1 Thiết kế mức thực nghiệm của các tham số trong quy trình xác định ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein 29 Bảng 2.2 Ma trận thí nghiệm theo DX – 2 Lever Factor 30 Bảng 2.3 Mức thực nghiệm dự kiến của các tham số tối ưu 32 Bảng 2.4 Ma trận thí nghiệm dự kiến tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase theo mô hình Box – Behnken 32 Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 34 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo hóa học của Chitin 6 Hình 1.2 Sơ đồ quy trình của Pháp, 1996 8 Hình 1.3 Quy trình Stevens - Học Viện Công Nghệ Châu Á (2001) 9 Hình 1.4 Quy trình xử lý kiềm một giai đoạn của Trần Thị Luyến (2003) 10 Hình 1.6 Quy trình sản xuất chitin – chitosan của Trung tâm Chế biến, 11 Hình 1.7 Quy trình sử dụng enzyme papain của Trần Thị Luyến, 2003 14 Hình 1.8 Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sĩ Trung, 16 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 26 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme 27 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả khử protein 28 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase 31 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung Alcalase đến hiệu quả khử protein 35 Hình 3.2 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng hoạt động của Alcalase 38 Hình 3.3 Đồ thị Half normal về ảnh hưởng của các nhân tố 38 Hình 3.4 Đồ thị về sự tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ Enzyme/nguyên liệu 39 Hình 3.5 Đồ thị thể hiện sự tương tác giữa nhiệt độ và thời gian 41 Hình 3.6 Đánh giá mức độ phù hợp của phương trình 43 vii Hình 3.7 Kết quả ANOVA phân tích các biến số 43 Hình 3 8 Kết quả phân tích ANOVA 44 Hình 3.9 Đường đồng mức về mối tương quan giữa thời gian và nhiệt độ tới hiệu quả khử protein 46 Hình 3.10 Đường đồng mức về mối tương quan giữa nồng độ enzyme và nhiệt độ tới hiệu quả khử protein 46 Hình 3.11 Quy trình đề suất khử protein đầu tôm bằng Alcalase 49 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây ngành chế biến thủy sản ở nước ta phát triển mạnh mẽ, các sản phẩm thủy sản của chúng ta đã vươn ra nhiều nước trên thế giới ngay cả những thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật Bản, Châu Âu… Ngành đã tạo công ăn việc làm cho hàng triệu người lao động. Bên cạnh đó còn đem về cho nhà nước một nguồn ngoại tệ không nhỏ nhờ việc xuất khẩu các mặt hàng thủy sản đặc biệt là mặt hàng thủy sản đông lạnh như: tôm, mực, cá….Trong đó tôm đông lạnh chiếm tỉ lệ không nhỏ trong tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 6 tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010 và là nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tính đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu về gần 2,4 tỷ USD, tăng 13,7% so với cùng kỳ năm 2010. Trong đó, tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD. Bên cạnh việc tăng sản lượng tôm xuất khẩu là lượng phế liệu tôm thải ra cũng tăng lên. Lượng phế liệu này có thể chiếm tới 40 – 60% trọng lượng tôm và có chứa nhiều thành phần có giá trị như: protein, chitin, astaxanthin. Do vậy hiện nay người ta đang tập trung nghiên cứu thu hồi chúng để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau trong đời sống. Protein có thể bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để tăng giá trị dinh dưỡng, nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi. Astaxasnthin cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Chitin và dẫn xuất của nó – chitosan – được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: trong công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, nông nghiệp, và một số ngành công nghiệp khác. Trong nhiều công trình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan trước đây, giai đoạn khử protein được xử lý bằng kiềm mạnh và khử khoáng bằng HCl với lượng lớn và nồng độ cao dẫn đến dịch protein thu được sau quá trình thường thải bỏ do có nồng độ hóa chất cao, gây ô nhiễm môi trường nếu không được xử lý hoặc việc 2 xử lý nước thải cũng khó khăn hơn. Mặt khác việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao còn gây cắt đứt mạch chitin làm giảm độ nhớt của chitosan. Gần đây đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng enzyme cho việc thu hồi protein, chitin nhưng chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào tối ưu hóa bằng enzyme Alcalase sử dụng phương pháp mặt đáp ứng. Có nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ enzyme, thời gian như trong nhiều báo cáo trước đây ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein bằng enzyme. Phương pháp mặt đáp ứng Box Benhken được thiết kế để đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố trên và tác động qua lại giữa chúng nhằm mục đích tối ưu hóa, cho ra giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán mà phương pháp thực nghiệm cổ điển chưa giải quyết được. Vì vậy đề tài: ”Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase” được thực hiện nhằm giải quyết hạn chế đã nêu. Mục tiêu đề tài: - Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein trên đối tượng đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase. - Áp dụng phương pháp mặt đáp ứng để thiết lập chế độ khử protein từ phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về việc sử dụng enzyme trong công nghệ sản xuất chitin, giúp hiểu biết sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử protein bởi Alcalase nói riêng và protease nói chung. từ các kết quả tối ưu thu được sẽ cho phép mô hình hoá quá trình chiết xuất chitin và thu hồi các sản phẩm hữu ích ở qui mô pilot và qui mô công nghiệp. Nội dung đề tài: - Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt sơ bộ nguyên liệu đến hiệu quả khử protein bằng enzyme Alcalase. - Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng khử protein của Alcalase. - Tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase sử dụng phương pháp mặt đáp ứng. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN PHẾ LIỆU TÔM 1.1.1 Khái quát về phế liệu tôm Trong công nghệ chế biến thuỷ sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến. Công nghệ chế biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu tôm và vỏ tôm, thường chiếm 50 – 70% nguyên liệu ban đầu (Đỗ Văn Nam và cộng sự, 2005 và Shahidi,1991) Phế liệu tôm chủ yếu gồm đầu và mảnh vỏ, ngoài ra còn có phần thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận và một số tôm bị hỏng. Phần đầu thường chiếm khối lượng 34 – 45% trọng lượng tôm nguyên liệu, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10 – 15%. Tuy nhiên tỷ lệ này tùy thuộc vào phương pháp gia công chế biến, giống loài và giai đoạn sinh trưởng của chúng [7]. Đối với tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii, phần đầu chiếm tới 60% trọng lượng tôm. Tôm sú Penaeus monodon thì đầu chiếm tới 40% trọng lượng tôm. Sản phẩm tôm bóc nõn, rút chỉ lưng, lượng đuôi và vỏ chiểm khoảng 25% trọng lượng tôm [4]. Bảng 1.1 Thành phần (%) đầu và vỏ phế liệu tôm [3] Phế liệu Protein Chitin Lipid Tro Canxi Phospho Đầu 53,5 11,1 8,9 22,6 7,2 1,68 Vỏ 22,8 27,2 0,4 11,7 11,1 3,16 Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 6 tháng đầu năm 2011, cả nước đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD, tăng 16,9% về khối lượng và 35,2% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010 và là nhóm hàng có mức tăng trưởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tính đến tháng 12/2011, xuất khẩu tôm của Việt Nam đã thu về gần 2,4 tỷ USD, tăng 13,7% so với cùng kỳ năm 2010. Trong đó, tôm sú đạt hơn 1,4 tỷ USD và tôm chân trắng đạt hơn 700 triệu USD. [33] [...]... Đánh giá hiệu quả xử lý nhiệt ban đầu và bổ sung enzyme Alcalase Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein bằng Alcalase Tối ưu quá trình khử protein bằng enzyme Alcalse Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26 2.2.3 Xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng Đầu tôm tươi Xác định độ ẩm Xác định hàm lượng khoáng Xác định hàm lượng protein Kết quả Hình 2.2 Bố trí... suất khử khoáng trong quy trình lên men vỏ tôm Theo N Bhaskar (2006) tối ưu hóa điều kiện lên men phế liệu tôm bằng Pediococus acidolactici CFR2182 sử dụng phương pháp mặt đáp ứng và ảnh hưởng các điều kiện sau khi tối ưu lên quá trình khử protein và khử khoáng và việc thu nhận carotenoid recovery 1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.5.1 Khái quát về enzyme Enzyme là những chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein. .. khác Phương pháp mặt đáp ứng là một công cụ hữu ích để nghiên cứu các quá trình phức tạp Nó đã được áp dụng thành công để tối ưu hóa điều kiện xử lý như nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme/ cơ chất đến mức độ thủy phân, thu nhận protein RSM xác định ảnh hưởng của các biến khác nhau, đơn lẻ hoặc đồng tác động Tác giả Wanna Choorit (2008) và cộng sự sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để. .. dễ dàng để ước lượng và áp dụng trong thực tế Thiết kế thí nghiệm ít 1.4.2 Nguyên lý Phương pháp bề mặt đáp ứng là một tập hợp các kỹ thuật thống kê và toán học hữu ích cho phát triển, cải thiện và tối ưu hóa quá trình RSM sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một phản ứng tối ưu Box và Wilson đề nghị sử dụng một mô hình đa thức bậc hai để làm điều này Để thiết kế chương trình cần... cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tôm Crangon cragon nhằm thu hồi chitin và protein Ban đầu vỏ tôm Crangon cragon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 200C trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 550C và pH 8,5 Dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (Nx6,25) Hàm lượng protein còn lại sau thủy phân khoảng 4% có thể do trong quá trình. .. xử lý nhiệt trên nguyên liệu đầu tôm tươi và việc bổ sung enzyme Alcalase Mỗi mẫu thí nghiệm lặp lại 3 lần 2.2.5 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein bằng Alcalase Nguyên liệu đầu tôm Xay nhỏ Nhiệt độ: 50 – 700C Thủy phân bằng enzyme Alcalase Thời gian: 2 – 8h Tỷ lệ E/S (v/w): 0,1 – 0,4% Tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1 Bã Dịch thủy phân Kiểm tra hiệu suất khử protein Hình... LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm Đối tượng nghiên cứu là đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) chế biến tại công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods F17 – Khánh Hòa 2.1.2 Enzyme Alcalase Đề tài sử dụng enzyme Alcalase 2.4L FG được mua tại công ty Novozyme, TP.HCM Hoạt tính enzyme Alcalase 2,4 AU-A/g Nhiệt độ bảo quản ở 40C pH = 7 – 8 Nhiệt độ 50 – 600C DH tối. .. chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và 13 Pacreatin Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein; 31,98% tro; và 19,92% chitin Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu 3%, nhiệt độ 600C, pH 8,5 Kết quả cho thấy rằng Alcalase có hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin,... 1.6 Quy trình sử dụng enzyme papain của Trần Thị Luyến, 2003 Nhận xét: Quy trình cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các sản phẩm khác Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất quy trình có ưu thế hơn hẳn (41,25%) Để nâng cao chất lượng chitin có thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng, chắc... Việt Nam và trên thế giới, như nghiên cứu của TS Trang Sĩ Trung, trường Đại học Nha Trang 16 Phế liệu vỏ đầu tôm thẻ Xay nhỏ - pH = 6,5 - Thời gian 6 giờ Khử protein bằng enzyme Flavourzyme - Nhiệt độ 50oC - Enzyme/ nguyên liệu 0,1% (v/w) Thu dịch protein astaxanthin Khử protein còn lại bằng NaOH - Thời gian 12 giờ - Nhiệt độ phòng loãng - NaOH 2% Rửa trung tính - Thời gian 6 giờ Khử khoáng bằng HCl - . quá trình khử protein trên đối tượng đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase. - Áp dụng phương pháp mặt đáp ứng để thiết lập chế độ khử protein từ phế liệu đầu tôm thẻ. quả khử protein bằng enzyme Alcalase. - Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng khử protein của Alcalase. - Tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase. chưa giải quyết được. Vì vậy đề tài: Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase được thực hiện nhằm giải quyết hạn chế