BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG LÊ THỊ VÂN ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN NHẰM ĐỊNH HƢỚNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nha Trang, tháng 06 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG LÊ THỊ VÂN ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN NHẰM ĐỊNH HƢỚNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN DUY Ths. NGUYỄN THỊ HẢI THANH Nha Trang, tháng 06 năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn Duy và cô Nguyễn Thị Hải Thanh, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên LÊ THỊ VÂN i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về probiotic 3 1.1.1. Giới thiệu chung 3 1.1.2. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 5 1.1.3. Tình hình ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản 7 1.1.3.1. Trên thế giới 7 1.1.3.2. Ở Việt Nam 8 1.2. Tổng quan về bacteriocin 9 1.2.1. Giới thiệu chung 9 1.2.2. Phân loại bacteriocin 10 1.2.3. Một số tính chất của dịch bacteriocin 12 1.2.3.1. Thành phần cấu tạo hóa học 12 1.2.3.2. Độ bền enzyme 13 1.2.3.3. Độ bền nhiệt 14 1.2.3.4. Độ bền pH 14 1.2.4. Cơ chế hoạt động của bacteriocin 14 1.2.5. Ứng dụng của bacteriocin 15 1.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn biển sinh bacteriocin 17 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu 19 2.1.1. Chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 19 2.1.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị 19 2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 19 ii 2.1.4. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 19 2.2. Quy trình thực hiện 22 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn sinh bacteriocin 23 2.3.1.1. Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc 23 2.3.1.2. Nhuộm Gram 23 2.3.2. Định danh vi khuẩn 24 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 25 2.3.4. Xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 26 2.3.4.1. Thử nghiệm catalase 26 2.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men các loại đường 26 2.3.4.3. Thử nghiệm khả năng sinh hơi 27 2.3.5. Xác định khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn 27 2.3.6. Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin 29 2.3.6.1. Thử với enzyme proteinase K và trypsin 29 2.3.6.2. Xác định độ bền với nhiệt độ của dịch bacteriocin 30 2.3.6.3. Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin 31 2.3.6.4. Xác định hoạt độ của dịch bacteriocin 31 2.3.7. Thí nghiệm xác định cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Đặc điểm hình thái và hóa sinh của vi khuẩn CT1.1 và G1 33 3.1.1. Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc 33 3.1.2. Nhuộm Gram 34 3.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn CT1.1 và G1 35 3.2. Định danh chủng CT1.1 37 3.3. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn CT1.1 và G1 39 3.4. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô của các chủng CT1.1 và G1 45 3.4.1. Kết quả thử độ bền với enzyme proteinase K và enzyme trypsin 45 3.4.2. Độ bền nhiệt độ của dịch bacteriocin thô 46 3.4.3. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô 48 iii 3.5. Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin sinh từ vi khuẩn CT1.1 và G1 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC BẢNG Bảng1.1. Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 13 Bảng 3.1. Khả năng lên men đường của các chủng CT1.1 và G1 36 Bảng 3.2. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 39 Bảng 3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD 600 ) và sản sinh bacteriocin của chủng CT1.1 theo thời gian nuôi cấy 40 Bảng 3.4. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng (OD 600 ) và sản sinh bacteriocin của chủng G1 41 Bảng 3.5. Đường kính vòng kháng Bacillus sp. B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 ở các độ pha loãng khác nhau 44 Bảng 3.6. Đường kính vòng kháng và khả năng kháng Bacillus sp. B1.1 còn lại của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 sau khi xử lý nhiệt độ 47 Bảng 3.7. Đường kính vòng kháng Bacillus sp. B1.1 và khả năng kháng còn lại của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 sau khi xử lý pH 48 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của bacteriocin 15 Hình 1.2. Số lượng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi thời kỳ 10 năm từ 1950-2010 được trích dẫn trên Pubmed. 18 Hình 2.1. Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri 28 Hình 3.1. Khuẩn lạc chủng CT1.1 nuôi cấy trên môi trường thạch TSA ở 37 o C 33 Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng G1 nuôi cấy trên môi trường thạch TSA ở 37 o C 33 Hình 3.3. Tế bào vi khuẩn CT1.1 sau khi nhuộm Gram 34 Hình 3.4. Tế bào vi khuẩn G1 sau khi nhuộm Gram 35 Hình 3.5. Thử nghiệm khả năng lên men đường của chủng CT1.1 36 Hình 3.6. Thử nghiệm khả năng sinh hơi của chủng CT1.1 (A) và G1 (B) sau 24 giờ nuôi cấy………………………………………………………………37 Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen chủng CT1.1 38 Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng CT1.1 nuôi trên môi trường TSB, ở pH 7 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 180 vòng/phút 40 Hình 3.9. Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng G1 nuôi trên môi trường TSB, ở pH 7 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 180 vòng/phút 41 Hình 3.10. Hoạt tính kháng Bacillus sp. B1.1 của dịch bacteriocin sinh bởi chủng G1 ở những nồng độ pha loãng khác nhau 44 Hình 3.11. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng CT1.1 với enzyme proteinase K và trypsin trên môi trường thạch TSA, vi khuẩn chỉ thị Vibrio sp. C1 45 Hình 3.12. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng G1 với enzyme proteinase K và trypsin trên môi trường thạch TSA, vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1 46 Hình 3.13. Vòng kháng Bacillus sp. B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 sau khi xử lý 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau 47 Hình 3.14 . Vòng kháng Bacillus sp. B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 sau khi xử lý ở pH 2÷12 49 Hình 3.15. Vòng kháng Bacillus sp. B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng G1 sau khi xử lý ở pH 2÷12 49 Hình 3.16. Ảnh hưởng của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 đến sinh trưởng của Bacillus sp. B1.1 51 Hình 3.17. Ảnh hưởng của dịch bacteriocin sinh từ chủng G1 đến sinh trưởng của Bacillus sp. B1.1 51 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Kí hiệu Chữ viết tắt 1 ATP Adenosine triphosphate 2 BLAST Basic Local Alignment Search Tool 3 CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) 4 DNA Deoxyribonucleotide Acid 5 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 6 OD Optical Density (mật độ quang) 7 PCR Polymerase Chain Reaction 8 RNA Ribonucleotide Acid 9 TBE Tris-borate-EDTA 10 TSA Tryptone Soya Agar 11 TSB Tryptone Soya Broth 1 LỜI MỞ ĐẦU Nuôi trồng thủy sản hiện là một trong những lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nhất nước ta. Sự phát triển về quy mô và đa dạng loài trong nuôi trồng thủy sản đã đem lại sự tăng vượt bậc về sản lượng nuôi trồng trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Tuy nhiên, dịch bệnh thường xuyên xảy ra đã gây nên thiệt hại lớn về kinh tế. Để phòng và trị bệnh, chất kháng sinh đã được sử dụng từ lâu nhưng do việc lạm dụng quá mức đã gây nên hiện tượng nhờn thuốc, giảm hiệu quả sử dụng, làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, tác động xấu đến môi trường nuôi, làm chất lượng giống kém, tỉ lệ sống không cao. Bên cạnh đó dư lượng kháng sinh có trong sản phẩm thủy sản không những gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng mà còn ảnh hưởng lớn đến sản lượng xuất khẩu các thực phẩm thủy sản khi dư lượng vượt quá mức cho phép. Vì vậy, các phương pháp thay thế thân thiện với môi trường như sử dụng vaccine, chế phẩm probiotic đã được đề xuất. Việc sử dụng vaccine thường tốn kém lớn về chi phí sản xuất, chi phí nhân công, hơn nữa các động vật bậc thấp chưa có hệ miễn dịch đặc hiệu nên việc sử dụng vaccine rất khó khăn, do vậy việc sử dụng chế phẩm probiotic từ vi khuẩn sinh bacteriocin có thể là giải pháp thay thế phù hợp. Bởi vì bacteriocin có khả năng kháng khuẩn tốt, đặc biệt tránh được dư lượng kháng sinh độc hại, an toàn, thân thiện với sức khỏe con người và môi trường. Trong nhiều năm qua bacteriocin thường được thu nhận từ vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ các loại thực phẩm nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, để ứng dụng trong phòng và trị bệnh cho lĩnh vực nuôi trồng thủy sản đòi hỏi vi khuẩn sinh bacteriocin phải được phân lập từ các sinh vật biển hoặc môi trường nước biển để thích nghi với điều kiện môi trường nuôi. Bên cạnh đó, vấn đề nghiên cứu vi khuẩn biển sinh bacteriocin còn rất mới ở nước ta. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đặc điểm sinh học và cơ chế kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin nhằm định hƣớng sản xuất chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản” [...]... tiêu của đề tài là xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin cũng như các tính chất của bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn của các vi khuẩn này có thể đóng góp thêm những hiểu biết mới về đa dạng sinh học, đặc điểm sinh lý – sinh thái – tiến hóa của vi sinh vật biển cũng như định hướng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Nội dung nghiên cứu của. .. phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột tôm cá, giúp đối tượng nuôi tăng trưởng và phát triển tốt, chống chọi được với các loại dịch bệnh Sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế vi c sử dụng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản, đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn trên... về vi khuẩn biển sinh bacteriocin còn rất mới ở nước ta Năm 2011, Tiến sĩ Nguyễn Văn Duy, Vi n Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng hải sản 19 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin. .. Chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Đặc điểm sinh học Định danh vi khuẩn Test hóa sinh Quan sát hình thái tế bào nhuộm Gram Xác định khả năng sinh trưởng Xác định khả năng sinh bacteriocin Xác định tính chất của dịch bacteriocin thô Xác định độ bền với enzyme proteinase K và trypsin Xác định độ bền với nhiệt độ Cơ chế kháng khuẩn Xác định độ bền với pH 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Xác định đặc điểm. .. vậy, chế phẩm probiotic còn có thể giúp cho nuôi trồng thủy sản chống chọi với tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là virus Đây có thể là một ưu thế lớn cho vi c sử dụng chế phẩm probiotic vào nuôi trồng thủy sản trong tương lai 1.1.3 Tình hình ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản 1.1.3.1 Trên thế giới Blancheton bổ sung các chất hữu cơ giàu nitơ vào nguồn nước để làm giầu vi khuẩn nitrit hóa và. .. động và cơ chế miễn dịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương và bacteriocin được nghiên cứu nhiều nhất là Colicin o Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương: các loại bateriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: vi c tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và. .. còn tương đối ít Trong những năm gần đây, Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh (Bộ Thủy sản, QĐ – BTS 18/2002) và nhiều nơi đã làm quen với vi c sử dụng các 9 chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt Tuy nhiên, chưa có một sự đánh giá toàn diện về hiệu quả kinh tế và phương pháp sử dụng các chế phẩm vi sinh này Một trong những cơ chế hoạt động của men vi sinh là các men... Garriques và Arevalo đã tóm lược quy trình sản xuất và sử dụng những vi khuẩn probiotic Vibrio alginolyticus để điều khiển hệ vi khuẩn trong vi c sản xuất giống tôm Penaeus vannamei ở Ecuador Chủng vi khuẩn giúp làm tăng tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng tôm một cách đặc biệt, do sự cạnh tranh với những vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng Vì vậy đã giảm nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh và chất hóa học. .. thái của vi khuẩn sinh bacteriocin 2.3.1.1 Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc Quan sát và mô tả hình dạng kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn, sử dụng phương pháp cấy ria và cấy điểm chủng vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa tương ứng Tiến hành: Hoạt hóa chủng vi khuẩn gốc được giữ trong glycerin bằng cách hút 1ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường TSB, ở điều kiện 37oC trong. .. nghiên cứu của đề tài bao gồm: - Đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin - Cơ chế kháng khuẩn - Một số tính chất của dịch bacteriocin (độ bền nhiệt, độ bền với enzyme, độ bền pH) 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về probiotic 1.1.1 Giới thiệu chung Theo Tổ chức nông nghiệp và lương thực của Liên hợp quốc (FAO): Probiotic là những vi sinh vật sống, nếu được bổ sung với liều . cũng như định hướng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: - Đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin. biển sinh bacteriocin nhằm định hƣớng sản xuất chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản 2 Mục tiêu của đề tài là xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin. VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG LÊ THỊ VÂN ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN