BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO CHỦNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA CHỦNG Salmonella choleraesuis Smith NHƯỢC ĐỘC MANG GEN CRP BỊ ĐỘT BIẾN GVHD : TS. VŨ KHẮC HÙNG Th.S. LÊ ĐÌNH ĐỨC SVTH : NGUYỄN HOÀNG OANH Lớp : 50 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khoá : 50 Nha Trang, tháng 6 năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin bày tỏ niềm tự hào vì đã được học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Nha Trang, một trong những trường có bề dày truyền thống trên 50 năm. Xin được gửi lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Vũ Khắc Hùng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Phân viện Thú Y miền Trung, và Thạc sĩ Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Phân viện Thú Y miền Trung, đặc biệt là anh Đỗ Văn Tấn và chị Đào Hoài Thu đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, giúp tôi hoàn thành khóa học và đồ án tốt nghiệp này. Nha Trang, tháng 7 năm 2011 Sinh viên NGUYỄN HOÀNG OANH i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU viii Chương 1. Tổng quan 1 1.1 Bệnh phó thương hàn lợn 1 1.1.1 Cơ chế sinh bệnh 3 1.1.2 Phương thức lây truyền 3 1.1.3 Triệu chứng 4 1.1.4 Bệnh tích 4 1.1.5 Chẩn đoán bệnh 4 1.1.6 Phòng và trị bệnh 6 1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith 7 1.2.1 Đặc điểm hình thái 8 1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 8 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 9 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 10 1.2.5 Sức đề kháng 13 1.2.6 Tính gây bệnh 14 1.3 Gen CRP 15 1.4 Phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 19 1.4.1 Nguyên tắc chung 19 1.4.2 Quy trình tạo DNA tái tổ hợp 20 1.5 Tình hình nghiên cứu gây đột biến trên một số gen gây bệnh của Salmonella 21 Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 ii 2.2 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.1 Vật liệu và môi trường 24 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Tách chiết plasmid 27 2.3.2 Tách chiết genome 28 2.3.3 Chiết tách, tinh sạch DNA 27 2.3.4 Phản ứng PCR nhân đoạn gen crp 30 2.3.5 Phản ứng cắt với enzyme giới hạn 31 2.3.6 Phản ứng lai ghép 32 2.3.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli JM109 và E.coli χ7213 32 2.3.8 Tạo chủng E.coli χ7213 khả biến 33 2.3.9 Tiếp hợp E.coli χ7213 và Salmonella choleraesuis 34 2.3.10 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa 35 Chương 3. Kết quả và thảo luận 37 3.1. Tạo chủng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 38 3.1.1. Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo - polymerase 38 3.1.2. Tạo dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 39 3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợpẠO pRE112/Δcrp 40 3.3. Tạo chủng S. choleraesuis Smith mang gen crp đột biến 41 3.3.1. Tiếp hợp E.coli χ7213/pRE112/Δcrp với S. choleraesuis 41 3.3.2. Sàng lọc dòng tế bào S. choleraesuis mang gen crp đột biến 42 3.4. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis nhược độc mang gen crp đã bị đột biến 44 3.4.1. Tốc độ sinh trưởng 44 3.4.2. Đặc tính sinh hóa 45 3.4.3. Tính ổn định của chủng đột biến 47 3.4.4. Giám định kháng nguyên H, O 48 3.4.5. So sánh trình tự gen của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δcrp 48 iii Kết luận và kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella 9 Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo Kauffman (1972) ) 12 Bảng 1.3 Các gen bị mất và chức năng của chúng trong phát triển các chủng Salmonella spp. đã giảm độc lực 22 Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.2 Thành phần của bộ kit QIApre spin Miniprep Kit của QIAgen 28 Bảng 2.3 Thành phần của bộ kit Blood&Tissue Extraction của QIAgen 27 Bảng 2.4 Thành phần của bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen 30 Bảng 2.5 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 30 Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE) 31 Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt plasmid bằng enzyme RE 32 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng lai ghép sử dụng T4 ligase 32 Bảng 3.1: Các đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và S.choleraesuis/Δcrp 47 v DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ Hình 1.1 Lợn con 3 tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis 2 Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn S. choleraesuis [31] 8 Hình 1.3 Khuẩn lạc S. choleraesuis trên thạch máu 24 giờ 9 Hình 1.4 Cấu trúc cAMP 15 Hình 1.5 Class I CAP-dependent promoter activation 16 Hình 1.6 Class II CAP-dependent promoter activation 16 Hình 1.7 Class III CAP-dependent promoter activation 16 Hình 1.8 Mối liên hệ giữa lượng đường và nồng độ cAMP.(Nguồn Scitable by nature education) 18 Hình 1.9 Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp với vector là plasmid, tế bào nhận là E.coli 20 Hình 1.10 Sàng lọc dòng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp thành công dựa vào gen kháng Ampicilin 21 Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là DNA tổng số của vi khuẩn S. choleraesuis với cặp mồi Pr1F-Pr2R, và Pr3F-Pr4R trên gel agarose 1,2%. 38 Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết vector pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN plasmid của 4 dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với BamHI/XbaI (B) và 3 dòng pBSIIK(+)/Δcrp (C) với XhoI/KpnI 40 Hình 3.3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân lên từ khuôn là plasmid tái tổ hợp pBSIISK+/Pr12-1/Pr34-1 bằng cặp mồi Pr1F-Pr4R trên gel agarose 1,2%. 40 Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 5 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pRE112/Δcrp bằng cặp enzyme XbaI và KpnI trên gel agarose 1,2%. 41 Hình 3.5 Các khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E.coli χ7213/pRE112/Δcrp-4 mọc trên môi trường chọn lọc LB + Cm. 42 vi Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 539/Δcrp (1), S. choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với cặp mồi Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2%. 43 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của S.chorelasuis Smith và S. chorelasuis 539/Δcrp sau 24h nuôi cấy 44 Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của các chủng S. choleraesuis Δcrp và S. choleraesuis Smith trong 10 giờ nuôi cấy 45 Hình 3.9 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và S.choleraesuis/Δcrp 46 Hình 3.10 Sản phẩm PCR từ genome của S. cholerasuis 539/Δcrp với cặp mồi Pr5F-Pr6R, Pr6R-Pr7F ở các đời 1, 5, 10, 15, 20 47 Hình 3.11 Trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi Pr5F- Pr6R của gen Δcrp với đoạn 322 bp (545-867) (bôi đen) bị mất so với gen crp của Salmonella choleraesuis nhược độc 49 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu Chữ viết tắt 1 CIP Calf alkaline phosphatase 2 Cm Chloramphenicol 3 Cm r Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol 4 Crp cAMP receptor protein 5 Δcrp gen crp bị đột biến 6 CAP catabolite activator protein - Protein hoạt hóa dị hóa 7 Asd aspartate β–semialdehyde dehydrogenase 8 LB Luria – Bertani 9 ST Stable toxin –Độc tố chịu nhiệt 10 PBS Phosphate buffer saline – Đệm Phosphate. 11 LPS Lypopolysaccharide 12 Km Kanamycin 13 LT Labile toxin – Độc tố không bền nhiệt 14 RE Enzyme cắt giới hạn 15 KDO 2-keto-3 dexyoctonate [...]... chủng và kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng Salmonella choleraesuis Smith mang gen crp đột biến Mục tiêu của đề tài - Tạo chủng plasmid pRE112/ crp Chuyển nạp plasmid pRE112/ crp vào chủng S cholerasuis Smith nhược độc gây đột biến gen crp - Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis Smith mang gen crp đột biến Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng plasmid pER112/ crp - Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid... Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pER112/ crp -Chuyển nạp plasmid pER112/ crp vào chủng S chorelasuis nhược độc gây đột biến gen crp - Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp - Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis nhược độc mang gen crp bị đột biến Ý nghĩa của đề tài Tạo chủng Salmonella cholerasuis Smith nhược độc mang gen crp đột biến làm chủng biến nạp để từ đó có thể tiếp tục nghiên... 3 loại cơ bản: đột biến ở gen sinh tổng hợp, gen điều hòa và gen liên quan đến tính độc[1] Chủng vắc-xin S choleraesuis Argus nhược độc được tạo ra bằng cách gây đột biến mất đoạn gen cyaA và gen crp Các đột biến này ảnh hưởng đến quá trình 22 vận chuyển và tổng hợp carbohydrate, các acid amine, các peptid, và glycogen Kết quả cho thấy chủng S choleraesuis đột biến không sản xuất H2S và khả năng lên... với chủng ban đầu (Curtis và cộng sự, 1993) [25] Ngoài ra người ta đã xây dựng được các chủng có hơn một đột biến mất đoạn Một chủng đột biến mất đoạn kép ở gen aro mã hóa enzyme tham gia tổng hợp chất thơm và ở gen pur mã hóa enzyme tham gia trao đổi purin Chủng đột biến kép này có thể mọc trên môi trường hoàn chỉnh và được làm giàu, thường chỉ gây lây nhiễm ở mức độ thấp Điển hình là độc lực của chủng. .. các gen cấu trúc Thể đột biến gen crp không sao mã được mRNA của operon lac, dẫn đến ix không tham gia chuyển hóa năng lượng, gây kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của S choleraesuis Như vậy, việc tạo chủng S choleraesuis mang gen crp bị đột biến phục vụ cho việc sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn là việc cấp thiết Do đó tôi tham gia thực hiện đề tài Tạo chủng và. .. nhày của ruột xâm nhập vào tế bào biểu mô Khả năng xâm nhập vào tế bào Eukaryota và vào lớp mucosa đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella cường độc Vi khuẩn Salmonella có 13 protein giúp vi khuẩn xâm nhập Các biến chủng của Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào, thường là các chủng không có độc lực Vi khuẩn xâm nhập vào trong tế bào Eukaryota là bước cần thiết tạo khả năng độc lực... hơn 100 lần so với chủng trước khi gây đột biến Chủng Salmonella giảm độc lực này là vắc-xin uống hiệu quả đối với chuột, cừu, gia súc, gà và người Đột biến mất gen dam mã hóa DNA methylase có thể sản xuất chủng Salmonella không độc Chuột được gây miễn dịch bằng chủng Salmonella Dam âm có sức chống chịu nhiều hơn 10000 lần so với liều gây chết bình thường [1] Bảng 1.3 Các gen bị mất và chức năng của... khuẩn biến dị, có thể xuất hiện các chủng nhược độc Các chủng Salmonella biến dị thì có độc lực thấp, thường được dùng để chế tạo vắc-xin 1.3 Gen CRP cAMP receptor protein (CRP) (còn được gọi là catabolite activator protein_CAP) là một gen điều hòa ở vi khuẩn [14] Hình 1.4 Cấu trúc cAMP [33] 16 Các gen được quy định bởi CRP chủ yếu tham gia chuyển hóa năng lượng từ những cơ chất như galactose, citrate... hoặc chủng cải biến của sinh vật gây bệnh trong đó gen độc đã được cải biến hoặc loại bỏ Trong trường hợp này, như là thành phần của vi khuẩn, các quyết định kháng nguyên quan trọng có mặt trong hệ miễn dịch có thành phần rất giống với dạng kháng nguyên ở sinh vật gây bệnh [1] Gen crp mã hóa CAP-protein hoạt hóa trao đổi chất kết hợp với cAMP tạo phức cAMP-CAP, phức này liên kết với promoter gây hoạt hóa. .. protein (crp) , adenylate cyclase (cya), type III secretion system 19 (T3SS) apparatus (ssaC, ssaJ and ssaV), Gifsy-1 prophage protein (gifsy-1), và Dgalactonate transport protein (dgoT) Tuy nhiên, chủng S choleraesuis Smith chỉ gây đột biến gen crp hoặc kết hợp gây đột biến các gen khác có tác dụng làm giảm độc lực và được sử dụng làm vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn 1.4 Phương pháp tạo DNA tái . độc gây đột biến gen crp. - Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith mang gen crp đột biến. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng plasmid pER112/ crp. - Kiểm tra kết quả tạo dòng. plasmid pER112/ crp. -Chuyển nạp plasmid pER112/ crp vào chủng S. chorelasuis nhược độc gây đột biến gen crp. - Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp. - Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis. và kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng Salmonella choleraesuis Smith mang gen crp đột biến . Mục tiêu của đề tài - Tạo chủng plasmid pRE112/ crp. Chuyển nạp plasmid pRE112/ crp vào chủng S.